Summary
Formålet med denne metode er at generere en in vivo model af tumor angiogenese ved xenografting pattedyrs tumorceller i en zebra embryo, der har fluorescently-mærkede blodkar. Ved billeddannelse af xenograft og tilhørende beholdere kan der opnås en kvantitativ måling af angiogen respons.
Abstract
Tumor angiogenese er et centralt mål for anti-cancer terapi og denne metode er blevet udviklet til at give en ny model til at studere denne proces in vivo. En zebra xenograft er skabt ved at implantering pattedyr tumorceller i perivitelline rum af to dage-post-befrugtning Zebra embryoner, efterfulgt af måling af omfanget af den angiogene respons observeret ved et eksperimentelt endepunkt op til to dage efter implantation. Den vigtigste fordel ved denne metode er evnen til præcist at kvantificere Zebra Host angiogenetisk respons på transplantatet. Dette muliggør detaljeret undersøgelse af de molekylære mekanismer samt værten vs tumor bidrag til angiogen respons. De xenografede embryoner kan underkastes en bred vifte af behandlinger, såsom inkubation med potentielle anti-angiogenesis narkotika, for at undersøge strategier til at hæmme tumor angiogenese. Den angiogene respons kan også være levende-imaged for at undersøge mere dynamiske cellulære processer. Den relativt krævende eksperimentelle teknik, billige vedligeholdelsesomkostninger for Zebra og kort eksperimentel tidslinje gør denne model specielt nyttig til udvikling af strategier til at manipulere tumor angiogenese.
Introduction
Angiogenesis er en af de klassiske kendetegn for kræft og repræsenterer et mål for anti-cancer terapi1,2. For at studere denne proces, xenograft modeller af kræft er blevet skabt ved at implantering pattedyr tumorceller i dyr som mus3. En zebra xenograft model er også blevet udviklet, som involverer implantation af tumorceller i 2 dage efter befrugtning (dpi) Zebra som resulterer i hurtig vækst af Zebra blodkarrene ind i xenograft4.
Denne protokol beskriver en in vivo Zebra embryo tumor xenograft-model, hvor den angiogene respons kan nøjagtigt kvantiteres på tværs af hele xenograft. Denne metode gør det muligt for investigator at undersøge, in vivo, de molekylære mekanismer, der understøtter tumor angiogen respons. Den genetiske tracerbarhed af Zebra tillader værten bidrag, der skal afhøres, mens udvælgelsen af forskellige tumorcellelinjer tillader tumor bidrag til angiogenese også undersøges5,6,7. Da Zebra larver er gennemtrængelige for små molekyler, kan der desuden anvendes specifikke pathway-hæmmere, eller lægemiddelbiblioteker kan screenes for at identificere nye hæmmere af tumor angiogenese8,9,10, 11.
Zebra embryo xenograft-modellen præsenterer unikke fordele sammenlignet med andre pattedyr-xenograft-modeller. Zebrafish xenografter er billigere og lettere at udføre, et stort antal dyr kan undersøges og levende celle billeddannelse tillader detaljeret undersøgelse af celle adfærd4. I modsætning til andre in vivo-modeller, som kræver op til flere uger for at observere signifikant fartøjs vækst, kan angiogenese i Zebra xenografter observeres inden for 24 timer efter implantation3,4. Men manglen på et adaptivt immunsystem i embryonale zebrafish, mens det er gavnligt at vedligeholde xenograft, betyder, at det adaptive immunrespons og dets bidrag til tumor angiogenese ikke kan undersøges. Desuden manglen på tumor stromale celler, den manglende evne til at ortotopisk implantat tumoren og forskellen i vedligeholdelses temperatur mellem Zebra og pattedyrceller er potentielle svagheder ved denne metode. Ikke desto mindre, den modtagelighed af denne model for levende billeddannelse og evnen til præcist at kvantificere den angiogene respons gør det enestående gavnligt for at studere de cellulære processer, der regulerer tumor angiogenese in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. klargøring af Mikroinjektionnåle
- Tænd en mikropipette aftrækker og sæt følgende parametre (kalibreret til mikropipetten aftrækker model opført i tabel over materialer): varme, 680; Træk, 75; Hastighed, 40; Tid, 55; Tryk: 530.
- Fastgør et borosilicatglas kapillær i mikropipette aftrækkeren, og træk kapillar for at lave to nåle. Gentag for så mange nåle som ønsket.
2. cellekultur til implantation
Bemærk: Når du bruger denne protokol, kan enhver pattedyrs Cancer cellelinje anvendes til implantation i Zebra embryoner som xenografts. Men, der er meget variation i angiogen respons induceret blandt forskellige cellelinjer5,11,12. B16-F1 murine melanom celler har vist sig at inducere en stærk angiogen respons i Zebra embryoner11 og er derfor passende til brug i denne protokol.
- Forøg B16-F1 celler ved 37 °C i en 75 cm2 kolbe ved hjælp af MEM-α medier suppleret med føtal bovint serum (FBS) til en endelig koncentration på 10% (v/v) og penicillin/streptomycin, hver i en endelig koncentration på 100 μg/ml.
- Fjern mediet fra en 95-100% flydende 75 cm2 kolbe af B16-F1-celler og vask cellerne i 5 ml rumtemperatur fosfat-bufferet saltvand (PBS).
- Fjern 5 mL PBS, tilsæt 2 mL rumtemperatur 0,25% trypsin/ethylenediaminetetraeddikesyre (EDTA) og Inkuber ved 37 °C i 60 s.
- Tryk på siden af kolben for at bestemme, om cellerne begynder at miste deres fastgørelse til bunden af kolben.
- Der tilsættes 8 mL rumtemperatur MEM-α med 10% FB'ER i kolben, pipette mod indersiden af kolben for at bringe celler, som forbliver i bunden af kolben, i suspension og pipetteres cellesuspensionen i et 15 mL rør.
- Centrifuger cellesuspensionen ved 800 x g, 4-8 °c i 5 minutter, Aspirér mediet og Fortsæt til mærkning af cellerne med farvestof.
3. mærkning B16-F1 celler med fluorescerende farvestof
Bemærk: For at skelne mellem de implanterede tumorceller og andre celler i embryonet, skal tumorcellerne mærkes med et passende fluorescerende farvestof før implantation. Dette trin kan springes over, hvis cellerne allerede udtrykker fluorescerende journalister.
- 2 mL serum frie MEM-α-medier inkubates ved 37 °C.
- Forbered en stamopløsning af det valgte farvestof og fortynder det i præ-inkuberet 2 mL serum-fri MEM-α-medier for at lave en brugbar koncentration (eksempler på farvestoffer og koncentrationer, der er passende for B16 F1-celler findes i tabel over materialer).
- 1 mL af farveopløsningen afpipetteres i celle pellet (fra trin 2,6), blandes grundigt ved pipettering, og tilsæt derefter de andre 1 mL farvestof opløsning og blandes.
- Cellerne og farveblandingen inkubates ved 37 °C i 40 min, blanding ved blid omrystning ved 20 min.
- Centrifugér cellesuspensionen ved 800 x g, 4-8 °c i 5 min.
- Du aspirerer supernatanten og vasker de mærkede celler ved pipettering med 5 mL PBS.
- Centrifuger cellesuspensionen igen ved 800 x g, 4-8 °c i 5 minutter, Aspirér supernatanten, og Placer cellerne på isen, indtil de er klar til implantation.
Bemærk: Den endelige tumor celle pellet skal have et volumen på 20-40 μL.
4. klargøring af embryoner til implantation
Bemærk: Vælg en transgene Zebra linje, der har fluorescently mærkede blodkar (f. eks kdrl: RFP, fli1a: egfp, etc.) 13 , 14.
- To dage før implantation, gyde Zebra som tidligere beskrevet og indsamle embryoner15.
Bemærk: Da vi ikke indsprøjte disse fisk på et tidligt tidspunkt, behøver de ikke at blive indsamlet inden for 20 min af gyde som beskrevet af rosen et al.15, men kan indsamles efter et par timers parring. - Placer embryonerne i 100 mm kultur retter med en densitet på ca. 100 embryoner/fad.
- Tilsæt 50 mL E316 (suppleret med 5 μl af en 1% w/v vandig stamopløsning af methylenblåt for at forhindre kontaminering) til hver skål, Rengør eventuelle døde embryoner eller snavs og opbevar skålen i en mørk inkubator ved 28 °c, indtil den er klar til injektion.
- Ved 1 dag efter befrugtning (DPF) tilsættes 1-phenyl-2-thiourea (PTU) til hver skål for at producere en endelig koncentration på 30 mg/L PTU i E3. PTU forhindrer pigmentering, som kan forstyrre evnen til at se tumorcellerne og blodkarrene.
- Ved 2 DPF, brug nåle eller pincet til manuelt at dechorionere alle embryoner, der er udklækket. Ved hjælp af et fluorescerende mikroskop skal du vælge så mange transgene embryoner som nødvendigt for xenografting (50-200).
- Før implantation anæstetiserer du de udvalgte embryoner i en opløsning på 300 μg/mL Tricain i E3 for at forhindre bevægelse under Indsprøjtnings proceduren.
- Fyld en 35 mm skål med en 2% methylcellulose i E3 opløsning til en fjerdedel af skålen.
- Brug en overførings pipette til at placere ca. 50 embryoner (hvilket minimerer mængden af E3-opløsning, der også overføres) på methylcellulose.
- Brug en pipettespids til Mikrolæsser til at arrangere embryonerne, så de alle er orienteret lodret, med hovederne til toppen og med venstre side opad.
Bemærk: Trin 4.7-4.9 kan også udføres ved at arrangere embryonerne på en agopstået blok som tidligere beskrevet17, men i vores erfaring, er embryonerne lettere arrangeret, når de er klædt i methylcellulose.
5. perivitellin injektion af pattedyrs cancer celler i 2 DPF-embryoner
Bemærk: For at sikre, at cellerne klumper sig sammen som et transplantat, når de implanteres, skal cellerne blandes sammen med en ekstracellulær matrix blanding (ECM). Vi har beskrevet trinene for at gøre sådan en celle/ECM-blanding, når du bruger en ECM-blanding, der refereres til i tabellen over materialer. Hvis der anvendes en alternativ matrix, skal trinene justeres i overensstemmelse hermed.
- En bestand af ECM opdeles i 100 μL aliquoter i 500 μL rør og opbevares ved-20 °C, indtil der er behov for det.
- Tø en alikvot af ECM og tilsæt 100 μL PBS for at fortynde blandingen til 50% (v/v).
Bemærk: Fortyndet 50% ECM kan opbevares ved 4 °C i op til 1 måned. - Bland 50% ECM godt med B16-F1-celle pellet (fra trin 3,7) ved pipettering og omrøring for at producere en blanding af celler/ECM i et 2:1-forhold og opbevar blandingen på is.
- Brug en mikrokapillær pipette, og tag 3-10 μL af cellerne.
- Indsæt forsigtigt pipettespidsen i en nål og skub B16-F1/matrix blandingen ud i enden af nålen.
- Sæt nålen ind i nåleholderen og VIP i en vinkel på 45 ° til skålen.
- Bryd spidsen af nålen ved hjælp af pincet til at gøre et hul stort nok til cellerne, der skal skubbes ud af nålen uden at klemme cellerne.
- Tænd den trykluft cylinder, der er fastgjort til Indsprøjtnings apparatet, og drej injektoren på "kontinuerlig" tilstand for at skubbe cellerne til spidsen af nålen.
- Fjern nålen ud af skålen og Udskift skålen med et hemocytometer.
- Placer en dråbe olie på hemocytometer og Injicer nålen en gang på denne dråbe.
- Tæl antallet af celler, der skubbes ud med en enkeltpuls ved hjælp af hemocytometer, og Kalibrer nålen for at skubbe ca. 150 celler pr. puls ved at justere puls varigheden.
Bemærk: Hvis du skubber denne mængde celler pr. puls ud, vil det kræve flere impulser for at kunne implantere et vellykket xenograft. Dette vil give forskeren mere kontrol over den endelige størrelse af tumor xenograft ved at tillade dem at moderat justere antallet/placeringen af pulser for at gøre hver xenograft større eller mindre, som de ønsker. - Peg nålen mod blommesækken af et embryo og skubbe den gennem blommesækken i en ventrale retning, indtil spidsen af nålen er dukket op fra æggeblomme SAC og skubber embryonale epidermis på den ventrale side af embryonet lige posterior til hjertet.
Bemærk: Placer nålen, så den kommer ind i Foster blomme SAC forreste til den endelige placering, hvor cellerne vil blive skubbet ud. Dette vil sikre, at cellerne vil blive skubbet i en retning væk fra hjertet, hvilket mindsker sandsynligheden for at injicere cellerne i den fælles kardinal vene. - Tryk forsigtigt spidsen af nålen fremad lidt, indtil det har skabt et rum (perivitelline rum) mellem epidermis og blomme SAC membranen og derefter puls injektoren til at skubbe nogle af celle blandingen ind i perivitelline rum.
- Gentag bælgfrugter indtil 500-800 celler er blevet injiceret i perivitelline rum, hvilket skaber en synlig bule, der strækker sig mindst halvdelen af vejen langs bunden af blommesækken, derefter fjerne nålen fra embryonet.
Bemærk: Hvis cellerne blokerer nålen eller beskadiges under injektionen, skal du rense nålen ved momentant at skifte til "kontinuerlig" tilstand og derefter tilbage til "Pulse". Dette bør fjerne blokeringen af nålen og tillade cellerne at blive skubbet frit og ubeskadiget. - Fortsæt med at gøre det samme for alle embryoner i skålen, lastning en ny nål med tumorceller, når det kræves.
- Efter injektion af alle embryonerne skal du fjerne nålen og skubbe alle embryonerne sammen ved hjælp af en mikrokapillær pipettespids, så de kan pipetteres ud med så lidt methylcellulose som muligt.
- Embryonerne overføres til en restitutions skål med E3 (med PTU og methylenblåt), og de vaskes ved forsigtigt at pipettere E3 omkring embryonerne.
Bemærk: På dette tidspunkt kan de xenografede embryoner behandles med lægemidler ved at adskille dem i forskellige retter og tilføje en lægemiddel opløsning til en skål og en kontrolopløsning (såsom lægemiddel køretøjet) til den anden skål. - Embryonerne inkubates ved 34 °C og udføres to gange daglig kontrol for at fjerne døde eller oedematøse embryoner fra skålen.
Bemærk: 34 °c viste sig at være den optimale temperatur for xenograft-vascularisering og er også blevet anvendt i andre undersøgelser, der anvendte Zebra embryo xenograft angiogenese model18. Xenografterne kan på et hvilket som helst tidspunkt imældes op til 48 HPI (timer efter implantation).
6. Live imaging
- På 48 HPI, identificere 3-5 sunde embryoner uden ødem. Bedøv dem i 150 μg/mL Tricain, og monter dem sideværts i 1% Lavsmelte punkt (LMP) agopstået som tidligere beskrevet19.
Bemærk: Da agat er størkne, skal du bruge en mikrokapillær pipettespids for at holde embryonerne placeret sideværts. - Tænd for confokal mikroskop, mikroskop controlleren, laserne og computer softwaren til styring af mikroskopet.
- Placer skålen på et Konfokal mikroskop. Ved hjælp af en 20x forstørrelse, vand dypning objektiv linse, placere xenograft i midten af feltet ved hjælp af lysfelt Imaging.
- Vælg excitation lasere, der er egnede til påvisning af farvestof, der anvendes til at mærke tumorcellerne og fluoroforet bruges til at mærke Zebra blodkarrene.
- Juster gevinsten for hver laser til et niveau, der gør det muligt at detekere både tumorcellerne og blodkarrene.
Bemærk: Når der er etableret konfokale indstillinger, skal disse holdes uændret i hele eksperimentet, så der kan foretages sammenligninger mellem xenografts. - Ved hjælp af den laser kanal passende for tumorcellerne, bestemme et volumen, der skal afbildet, som omfatter hele mængden af xenograft, giver mulighed for mindst en eller to optiske sektioner hver side af transplantatet. Brug sektions intervaller, der er omkring 5 μm fra hinanden, til at oprette en z-stak.
Bemærk: Det er vigtigt, at z-stakken indeholder hele mængden af xenograft. - Ved hjælp af to kanal billeder, billede både tumor xenograft og blodkarrene. Gentag trin 6.6-6.7 for hver larve, der skal imældes.
7. tidsforskudt billeddannelse
Bemærk: Denne model er meget velegnet til billeddannelse dynamiske cellulære processer på grund af sin gennemsigtighed og tilgængeligheden af Zebra transgenics at fluorescently label forskellige celletyper. Dette gør time-lapse Imaging en vigtig anvendelse af denne model.
- Tænd for miljøkammeret og Indstil til 34 °C mindst 2 timer før billeddannelse. Hvis kammeret ikke er befuret, tilsættes retter af vand.
- Anæstetize 3-5 embryoner (med 120 μg/mL Tricain ved 2 DPF og 100 μg/mL Tricain ved 3 DPF) og monter dem sideværts i 0,8% LMP agopstået for tidsforskudt billeddannelse i henhold til den tidligere beskrevne protokol19.
Bemærk: Da agat er størkne, skal du bruge en mikrokapillær pipettespids for at holde embryonerne placeret sideværts. - Indstil udstyret og billedet xenograft som beskrevet i trin 6.2-6.7, erhverve z-stakke af xenograft med 10 min intervaller.
Bemærk: Embryonet skal holdes på 34 °c, da det bliver afbildet, og E3 oven på larverne i agar skal kontrolleres og suppleres lejlighedsvis for at sikre, at det ikke tørrer ud.
8. kvantitation af det angiogene respons på Zebrafish xenograft
Bemærk: følgende trin bruger 3D-billedanalyse software. Specifikke trin vil variere afhængigt af den anvendte software.
- Overfør z-stack confokale billedfiler af en tumor xenograft til en ny mappe på 3D-billedanalyse software.
Bemærk: For at kvantificere niveauerne af tumor vaskularisering, skal der oprettes måleprotokoller med indstillinger kalibreret, så de kan bruges til at måle enten Tumorvolumen eller fartøjets volumen for alle xenografts. - For at oprette "tumor Volume"-protokollen til måling af volumen af tumor xenografts, gå til "måling" fanen i den øverste menu og derefter trække protokollerne med navnet "Find objekter" fra listen over protokoller, der vises i venstre side af vinduet til rummet med titlen "træk opgaver her for at foretage målinger".
- Sørg for, at denne protokol er indstillet til at måle objekter i tumor kanalen, og træk derefter protokollerne "klip til ROIs" og "lav ROI fra population" fra listen over protokoller til "træk opgaver her for at gøre målinger" plads. Sørg for, at disse to kommandoer gælder for de objekter, der identificeres med "Find objekter".
- Før du kalibrerer indstillingerne for denne protokol, skal du gå til rullemenuen over "mode"-etiketten øverst til venstre i vinduet og vælge visningen "udvidet fokus".
- Fravælg de ikke-tumor kanaler i ruden længst til højre ved at klikke på den sorte cirkel under hver kanal overskrift, så kun tumor Kanalen kan ses. Brug "Freehand" værktøjet i toppen af vinduet til at tegne en "region af interesse" (ROI) omkring alle tumorvolumen.
Bemærk: Vær forsigtig for at sikre, at ingen af tumoren er udeladt af ROI. Dette vil give en region, hvor du skal udføre protokollen, når du kalibrerer indstillingerne. - Vælg "Resumé" etiketten i panelet under billedet, og Indstil "Display" mulighed for at vise "population 2". For at kalibrere, klik på stjernen på Find objekter opgave, som vil åbne vinduet Indstillinger. Juster "tærskel" ved hjælp af "intensitet" og bestemmelse af "nedre" tærskel, indtil kun tumorcellerne er valgt, og ikke baggrunden fluorescens.
Bemærk: Dette er vigtigt, så kun fluorescens fra tumorcellerne i det valgte ROI (tegnet i 8,5) detekteres, og ingen af baggrunden fluorescens måles. - Bestem "mindste objektstørrelse", så kun intakte celler måles i modsætning til mindre elementer af cellerester (f. eks. ved at indstille "minimum objektstørrelse" som 100 μm3). Gem denne protokol som "tumor volumen" ved at klikke på fanen målinger i den øverste menu og klikke på "SAVE Protocol", og brug de samme indstillinger til at måle alle xenografts.
- For at måle mængden af xenograft-associerede blodkar, skal du lave en ny protokol. Gå til den øverste menu, klik på fanen målinger, og klik på "Ryd protokol". Træk opgaverne "Find objekter" og "klip til ROIs" ind i det område, der har overskriften "træk opgaver her for at foretage målinger" for denne protokol.
- Kontroller, at den første kommando er indstillet til at måle objekter i blodkar kanalen, og at følgende kommando er indstillet til at gælde for de objekter, der identificeres af den første kommando. Fravælg derefter de ikke-fartøjs kanaler i den yderste højre rude, så kun blodkarrene kan ses.
- Bestem indstillingerne for "fartøjets volumen" på samme måde som for protokollen "tumor volumen" og Gem denne protokol som "fartøjets volumen" (Se 8.6-8.7).
- Ryd protokollen og tegn et ROI omkring xenograft, pas på ikke at inkludere nogen ikke-tumor autofluorescens. Mål summen af volumen af objekterne i tumor kanalen inde i denne ROI ved at klikke på fanen målinger, vælge den "Restore Protocol" kommando og vælge "tumor Volume" protokol.
- Brug den nye ROI foretaget af "tumor Volume" protokol, skal du bruge "fartøj Volume" protokol til at måle den samlede mængde af objekter i skibet kanalen inde i denne ROI ved at klikke på fanen målinger, vælge "Restore Protocol" kommando og vælge "fartøj Volume "-protokollen.
- Opdel fartøjets volumen ved tumorvolumen og Multiplicer svaret med 100 for at opnå en procentværdi af transplantat vaskularisering.
- Gentag trin 8,11 til 8,13 for alle de andre xenografts.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved billeddannelse af et individuelt xenograft ved 6, 24 og 48 HPI kan det angiogene respons ved forskellige tidspunkter beregnes som vist i figur 1a-C. Den største angiogen respons er observeret mellem 24-48 h post implantation, med de maksimale niveauer af transplantatet vaskularisering set omkring 2 dpi (figur 1a-C). En time-lapse film af en typisk angiogen respons på en B16-F1 xenograft fra 20,75 HPI indtil 46 HPI ses i supplerende film 1. Denne film blev genereret af Imaging et xenograft implanteret efter denne protokol i en 2 DPF kdrl: EGFP embryo. De fartøjer, der vokser gennem xenograft, danner et indviklet netværk med fartøjer af irregulær størrelse og morfologi, hvilket er typisk for det unormale vaskulære netværk, der ses i pattedyrs tumorer20. Den angiogene respons i vores model er et resultat af fartøjer, der spire fra den fælles kardinal vene ind i xenograft i modsætning til tidligere undersøgelser, som har rapporteret subintestinale vener som kilden til de fartøjer, der vokser ind i xenograft4. Forskellen i fartøjs oprindelse skyldes det faktum, at vi har implanteret vores xenografter i en mere ventrale placering i perivitelline rummet, da dette gør det lettere at visualisere formen og størrelsen af xenograft under injektion og billeddannelse20.
Figur 1d -F viser repræsentative resultater af B16-F1 xenografter og deres tilhørende vaskulatur efter behandling med enten DMSO (Control) eller 50 nm af en vegfr-hæmmer (tivozanib)21,22. Umiddelbart efter implantation blev xenograferet embryoner opdelt i to grupper, og enten 50 nM Tivozanib eller DMSO (0,5% v/v) blev anvendt på hver gruppe. De blev opretholdt i disse stoffer før Imaging på 2 dpi. Disse resultater viser, at de fartøjer, der er associeret med xenografter inkuberet i vegfr-inhibitor (figur 1E), er langt mindre talrige end de fartøjer, som er associeret med xenografter, inkuberet i DMSO (figur 1d). I kontrol embryoner er der et ekspansivt vaskulære netværk, der strækker sig over hele xenograft-regionen (figur 1d), som er det typiske angiogene respons observeret efter implantation af B16-F1-celler. I figur 1fer det angiogene respons blevet kvantiteret ved at følge denne protokol, og det viser en klar reduktion i transplantatet vaskularisering i vegfr-inhibitor-behandlede xenografter sammenlignet med kontrol. På trods af normalisere niveauerne af transplantat vaskularisering mod transplantat volumen, der er stadig en stor variation i niveauerne af transplantat vaskularisering på 48 HPI (variationskoefficient på 54,2%). Dette skyldes variationen i det totale volumen af tumor skibene (variationskoefficient 73,3%); vi bemærkede, at selv tilsvarende størrelse grafts havde stor variation i niveauet af vascularization. Derfor anbefales det, at der anvendes ca. 20 xenografter pr. behandlingsgruppe.
De skridt, der er taget for at kvantificere de fartøjer, der er associeret med xenograft fra figur 1d , er vist i figur 2. Tumor kanalen er vist alene i figur 2a, hvor en masse af B16-F1-celler fluorescently-mærket (falsk farvet grøn) kan ses under blommesækken, som viser autofluorescens. En ROI skal omhyggeligt trækkes omkring xenograft (figur 2a'), passe på ikke at medtage nogen af autofluorescens fra blommesækken som tumorvolumen protokol kan derefter identificere denne autofluorescens som en del af tumoren. Udførelse af tumor volumen protokol identificerer alle B16-F1 celler i ROI, måler deres volumen og clips ROI til deres volumen (figur 2a' '). Udførelse af tumor fartøjs volumen protokol i dette nye klippede ROI gør det muligt at identificere alle de fartøjer, der er forbundet med massen af B16-F1-celler og måler deres volumen (figur 2a'' '). Værdierne fra tumorvolumen og tumor fartøj volumen protokoller kan bruges til at give et mål for transplantatet vaskularisering som derefter plottet i en graf, som det ses i figur 1f.
Figur 1: Zebrafish tumor xenograft vaskularisering hæmmes af en VEGFR-signalering-hæmmer. (A-C) Konfokale billeder af et levende embryo ved 6 HPI (a), 24 HPI (B) og 48 HPI (C) med gfp-mærkede blodkar (magenta). % Transplantat vascularisering blev beregnet og inkluderet i det tilsvarende panel. (D-E) Konfokale billeder af levende Zebra larver vist ved 48 HPI med fluorescently-mærkede B16-F1 xenografter (grøn) og gfp-mærkede blodkar (magenta), som blev behandlet umiddelbart efter implantation med enten 0,5% (v/v) DMSO i E3 (D) eller 50 nm af en VEGFR-hæmmer (Tivozanib) i E3 (E). Fartøjs kanalerne for d og e vises isoleret i henholdsvis d' og e'. F) graf, som viser data fra kvantificering af% transplantat vaskularisering ved 48 HPI i disse xenografts, n = 42 (DMSO), n = 20 (vegfr-hæmmer). * * p > 0,01 af Mann-Whitney test, fejllinjer repræsenterer s.d. Scale bar = 50 μm. Oplysningerne i figur 1f gengives11.
Figur 2: kvantificering af transplantat vaskularisering. Confokal billede af levende 2 dpi Zebra larver med fluorescently-mærkede B16-F1 xenografter (grøn) og gfp-mærkede blodkar (magenta). (A) tumor kanal forud for tegning af et investeringsafkast. (A') Der trækkes et ROI omkring xenograft-regionen, hvilket sikrer, at autofluorescens i æggeblomme ikke er inkluderet. (A' ') Den "tumor Volume" protokol er udført for at identificere mængden af xenograft inde i ROI og også skaber en ny ROI. (A' ' ') Den "tumor fartøj volumen" protokol bruges til at identificere mængden af fartøjer inde i den nye ROI. Scale bar = 50 μm.
Supplerende film 1: tumor xenograft angiogenesis. Confokal time-lapse billeddannelse af et B16-F1 xenograft implanteret i et 2 DPF Zebra embryo med gfp-mærkede blodkar (kdrl: egfp). Film taget fra 20,75 HPI til 46 HPI. Time-lapse billede z-stakke blev indsamlet 10 min fra hinanden; filmen blev lavet med 7 billeder pr. sekund. Scale bar = 50 μm. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det første kritiske trin i protokollen er implantation af tumorceller. Det er vigtigt, at cellerne injiceres på et sted, der gør det muligt for xenograft at implantatet med succes i embryonet uden at gøre embryonet edematous. En injektion, der er for forreste kan tillade cellerne at bevæge sig mod hjertet, blokerer blodbanen og fører til ødem, mens en injektion, der er for posterior vil resultere i en dårligt implanteret xenograft. En forreste injektion er bedst undgås ved at indsætte nålen gennem blommesækken i en forreste til posterior retning, så det peger væk fra hjertet, da det sprøjter. En posterior injektion undgås bedst ved at injicere cellerne på et sted i den forreste halvdel af den runde del af blommesækken. Desuden skal cellerne injiceres ventrale til blommesækken og ikke lateral til det, da den laterale placering er vanskeligere at se og efterfølgende billede. Når forskeren er rimelig dygtig til denne proces, kan ca. 200-300 embryoner implanteres med xenografter hver dag. Billeddannelse af angiogenisk respons vil tage længere tid på grund af tiden, det tager at montere og afbilde xenografterne; det tager cirka en time at billed 15-20 xenografter ved hjælp af en standard laser-scanning confokale mikroskop.
Det andet kritiske trin er målingen af transplantat vaskularisering ved hjælp af 3D billedanalyse software. Kvantitation af tumorvolumen er nødvendig, da det er vanskeligt at opnå konsekvent størrelse xenografter gennem mikroinjektion. Det er nødvendigt at kalibrere indstillingerne for software protokollerne omhyggeligt og bruge dem konsekvent for at opnå nøjagtige og objektive kvantitative målinger for alle eksperimenter. Fastsættelse af minimumstærsklen for intensitet (for både Tumorvolumen og tumor fartøj volumen) er en vigtig del af dette trin, da det gør det muligt for protokollen at korrekt diskriminere mellem fluorescens, der er en del af tumoren/blodkar og baggrunden fluorescens. Tegning af ROI omkring tumor xenograft til kun at omfatte tumor xenograft og ikke nogen lyse autofluorescing dele af embryonet (såsom blomme SAC) er også vigtigt; utilsigtet medtagelse af eventuelle ikke-tumor autofluorescing regioner eller ikke-tumor blodkar i ROI vil resultere i disse dele, der måles som en del af "tumorvolumen" eller "tumor fartøj volumen", hvilket skaber betydelige unøjagtigheder i den endelige beregning. Der er altid en stor variation i angiogen respons (Se figur 1f), men i stedet for at være en begrænsning af modellen, kan dette blot afspejle den naturlige varians i tumor fartøjs tæthed observeret hos både humane patienter og murine xenografter 23 , 24. kvantiseringen af transplantatet vaskularisering i 60 xenografter vil tage ca. 1 h.
Omhyggelig udvælgelse af tumor cellelinje er også vigtigt, da der er en bred variation i angiogen respons induceret mellem forskellige pattedyr cellelinjer, som kan vedrøre de forskellige niveauer af Pro-angiogene molekyler produceret af disse celler4 , 11. i vores hænder, B16-F1 mus melanom celler giver en robust angiogen respons, muligvis på grund af det høje niveau af vegfa sekretion fra disse celler11. Mulige ændringer til denne protokol ville være brugen af Zebra melanom celler, hvilket ville gøre det muligt for analyse temperaturen at blive sænket til 28 ° og derfor være optimal for både vært og tumor25 eller brug af kræftceller, der overudtrykker Pro-angiogen vækstfaktorer såsom FGF4,7,20.
Nogle af fordelene ved denne model ligger i dens korte tidshorisont, lave omkostninger og den relative lethed, hvormed xenotransplantations proceduren kan gennemføres sammenlignet med andre in vivo-modeller såsom murine xenografts, som alle gør den meget modtagelig for brug til omfattende undersøgelser (dvs. kemiske skærme til anti-angiogene forbindelser26). Evnen til at leve billede modellen og tilgængeligheden af transgene fisk med fluorescently mærkede blodkar og andre celletyper giver forskerne mulighed for at studere detaljerne i angiogeneseprocessen (f. eks. fartøjets spiring) samt celle cellen interaktioner (såsom makrofag-endotelinteraktioner), der finder sted under angiogenese i denne model11,20,27. Da fartøjs normalisering også er et centralt mål for antiangiogen behandling, betyder høj opløsning Live-imaging af det vaskulære netværk i xenografter, at denne model har potentiale til at identificere behandlinger, der er rettet mod dette mål. Netværks-tortuositet kunne undersøges ved at tælle antallet af fartøjs branchpoints, mens fartøjs morfologi kunne undersøges ved at måle variationer i fartøjs bredden, hvilket tillod, at Pro-normaliserings behandlinger blev afprøvet og evalueret i denne model28. Desuden kan fluorescens mikroangiografi anvendes til at bestemme patency og integriteten af tumor fartøjer29. Den genetiske tracerbarhed af Zebra betyder også, at det kan være genetisk modificeret til at undersøge rollen af forskellige vært signalerings veje i tumor angiogenese6. Denne model kan derfor bruges til at identificere nye anti-angiogeniske forbindelser, der er aktive i en tumor indstilling samt studere cellulære og molekylære interaktioner, der regulerer tumor angiogenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker hr. alhad mahagaonkar for forvaltningen af University of Auckland Zebra facilitet og biomedicinsk billed forskning enhed, School of Medical Sciences, University of Auckland, for assistance i time-lapse confokal mikroskopi. Dette arbejde blev støttet af et sundheds Forskningsråd i New Zealands projekt bevilling (14/105), et kongeligt selskab i New Zealands Marsden fund-projekt bevilling (UOA1602) og et projekttilskud fra Auckland Medical Research Foundation (1116012) tildelt J.W.A.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air cylinder | BOC | 011G | Xenotransplantation |
| B16-F1 cells | ATCC | Cell culture | |
| BD Matrigel LDEV-free (extracellular matrix mixture) | Corning | 356235 | Xenotransplantation |
| Borosillicate glass capillaries | Warner Instruments | G100T-4 | OD = 1.00 mm, ID = 0.78 mm, Length = 10 cm Cell injection |
| Cell culture dish 35 mm diameter | Thermofisher NZ | NUN153066 | Fish husbandry |
| Cell culture dish 100 mm diameter | Sigma-Aldrich | CLS430167-500EA | Fish husbandry |
| Cell culture flask 75 cm2 | In Vitro Technologies | COR430641 | Cell culture |
| CellTracker Green | Invitrogen | C2925 | Cell labelling, Stock concentration (10 mM in DMSO), working concentration (0.2 μM in serum-free media) |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | Drug treatment, Cell labelling |
| E3 Media (60x in 2 L of water) 34.8 g NaCl 1.6 g KCl 5.8 g CaCl2·2H2O 9.78 g MgCl2·6H2O adjust to pH 7.2 with NaOH |
In house [1] | Fish husbandry | |
| Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521 | Xenotransplantation, Imaging |
| Filter tip 1,000 μL | VWR | 732-1491 | Used during multiple steps |
| Filter tip 200 μL | VWR | 732-1489 | Used during multiple steps |
| Filter tip 10 μL | VWR | 732-1487 | Used during multiple steps |
| Fluorescence microscope | Leica | MZ16FA | Preparation of embryos |
| FBS (NZ origin) | Thermofisher Scientific | 10091148 | Cell culture |
| Gloves | Any commercial brand | Used during multiple steps | |
| Haemocytometer cell counting chamber Improved Neubauer | HawksleyVet | AC1000 | Xenotransplantation |
| Heraeus Multifuge X3R Centrifuge | Thermofisher Scientific | 75004500 | Cell culture, Cell labelling |
| Hoechst 33342 | Thermofisher Scientific | 62249 | Cell labelling, Stock concentration (1 mg/ml in DMSO), working concentration (6 μg/ml in serum-free media) |
| Low Melting Point, UltraPure Agarose | Thermofisher Scientific | 16520050 | Imaging |
| Methycellulose | Sigma-Aldrich | 9004 67 5 | Xenotransplantation |
| Methylene blue | sigma-Aldrich | M9140 | Fish husbandry |
| Microloader 0.5-20 μL pipette tip for loading microcapillaries | Eppendorf | 5242956003 | Xenotransplantation |
| Micropipettes | Any commercial brand | Used during multiple steps | |
| Micropipette puller P 87 | Sutter Instruments | Xenotransplantation | |
| Microscope cage incubator | Okolab | Time-lapse imaging | |
| Microwave | Any commercial brand | Imaging | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M3516 | Xenotransplantation |
| Minimal Essential Media (MEM) - alpha | Thermofisher Scientfic | 12561056 | Cell Culture |
| MPPI-2 Pressure Injector | Applied Scientific Instrumentation | Xenotransplantation | |
| Narishige micromanipulator | Narishige Group | Xenotransplantation | |
| Nikon D Eclipse C1 Confocal Microscope | Nikon | Imaging | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | Fish husbandry |
| PBS | Gibco | 10010023 | Cell culture |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | Cell culture |
| S1 pipet filler | Thermoscientific | 9501 | Cell culture |
| Serological stripette 10 mL | Corning | 4488 | Cell culture |
| Serological stripette 25 mL | Corning | 4489 | Cell culture |
| Serological stripette 5 mL | Corning | 4485 | Cell culture |
| Serological stripette 2 mL | Corning | 4486 | Cell culture |
| Terumo Needle 22 G | Amtech | SH 182 | Fish husbandry |
| Tissue culture incubator | Thermofisher Scientfic | HeraCell 150i | Cell culture |
| Tivozanib (AV951) | AVEO Pharmaceuticals | Drug treatment | |
| Transfer pipette 3 mL | Mediray | RL200C | Fish husbandry |
| Trypsin/EDTA (0.25%) | Life Technologies | T4049 | Cell culture |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11295-10 | Fish husbandry |
| Volocity Software (v6.3) | Improvision/Perkin Elmer | Image analysis |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A.
- Huang, D., et al. Sunitinib acts primarily on tumor endothelium rather than tumor cells to inhibit the growth of renal cell carcinoma. Cancer Research. 70 (3), 1053-1062 (2010).
- Ribatti, D. Tumor Angiogenesis Assays. , 1st. edn, Humana Press. (2016).
- Nicoli, S., Ribatti, D., Cotelli, F., Presta, M. Mammalian tumor xenografts induce neovascularization in zebrafish embryos. Cancer Research. 67 (7), 2927-2931 (2007).
- He, S., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. Journal of Pathology. 227 (4), 431-445 (2012).
- Ablain, J., Durand, E. M., Yang, S., Zhou, Y., Zon, L. I. A CRISPR/Cas9 vector system for tissue-specific gene disruption in zebrafish. Developmental Cell. 32 (6), 756-764 (2015).
- Astin, J. W., et al. Vegfd can compensate for loss of Vegfc in zebrafish facial lymphatic sprouting. Development. 141 (13), 2680-2690 (2014).
- Yang, J. H., Hu, J., Wan, L., Chen, L. J. Barbigerone inhibits tumor angiogenesis, growth and metastasis in melanoma. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 15 (1), 167-174 (2014).
- Zhang, S., et al. SKLB1002, a novel potent inhibitor of VEGF receptor 2 signaling, inhibits angiogenesis and tumor growth in vivo. Clinical Cancer Research. 17 (13), 4439-4450 (2011).
- Muthukumarasamy, K. M., et al. Identification of noreremophilane-based inhibitors of angiogenesis using zebrafish assays. Organic & Biomolecular Chemistry. 14 (5), 1569-1578 (2016).
- Britto, D. D., et al. Macrophages enhance Vegfa-driven angiogenesis in an embryonic zebrafish tumor xenograft model. Disease Models & Mechanisms. 11 (12), (2018).
- Nicoli, S., Presta, M. The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay. Nature Protocols. 2 (11), 2918-2923 (2007).
- Huang, H., Zhang, B., Hartenstein, P. A., Chen, J. N., Lin, S. NXT2 is required for embryonic heart development in zebrafish. BMC Developmental Biology. 5, 7 (2005).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Developmental Biology. 248 (2), 307-318 (2002).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish: A Practical Approach. , Oxford University Press. (2002).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).
- Fior, R., et al. Single-cell functional and chemosensitive profiling of combinatorial colorectal therapy in zebrafish xenografts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (39), E8234-E8243 (2017).
- Eng, T. C. Y., Astin, J. W.
- Zhao, C., et al. A novel xenograft model in zebrafish for high-resolution investigating dynamics of neovascularization in tumors. PloS One. 6 (7), e21768 (2011).
- Nakamura, K., et al. KRN951, a highly potent inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor tyrosine kinases, has antitumor activities and affects functional vascular properties. Cancer Research. 66 (18), 9134-9142 (2006).
- Okuda, K. S., et al. A zebrafish model of inflammatory lymphangiogenesis. Biology Open. 4 (10), 1270-1280 (2015).
- Steinberg, F., Konerding, M. A., Streffer, C. The vascular architecture of human xenotransplanted tumors: histological, morphometrical, and ultrastructural studies. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 116 (5), 517-524 (1990).
- Vermeulen, P. B., et al. Microvessel quantification in primary colorectal carcinoma: an immunohistochemical study. British Journal of Cancer. 71 (2), 340-343 (1995).
- Heilmann, S., et al. A Quantitative System for Studying Metastasis Using Transparent Zebrafish. Cancer Research. 75 (20), 4272-4282 (2015).
- Okuda, K. S., Lee, H. M., Velaithan, V., Ng, M. F., Patel, V. Utilizing Zebrafish to Identify Anti-(Lymph)Angiogenic Compounds for Cancer Treatment: Promise and Future Challenges. Microcirculation. 23 (6), 389-405 (2016).
- Zhao, C., et al. Endothelial Cords Promote Tumor Initial Growth prior to Vascular Function through a Paracrine Mechanism. Scientific Reports. 6, 19404 (2016).
- Goel, S., Wong, A. H., Jain, R. K. Vascular normalization as a therapeutic strategy for malignant and nonmalignant disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (3), a006486 (2012).
- Schmitt, C. E., Holland, M. B., Jin, S. W. Visualizing vascular networks in zebrafish: an introduction to microangiography. Methods in Molecular Biology. , 59-67 (2012).
