Purification des fibroblastes et des cellules de Schwann des nerfs sensoriels et moteurs in vitro
Summary
Ici, nous présentons une méthode pour purifier les fibroblastes et les cellules de Schwann des nerfs sensoriels et moteurs in vitro.
Abstract
Les principales cellules du système nerveux périphérique sont les cellules Schwann (SC) et les fibroblastes. Ces deux cellules expriment distinctement les phénotypes sensoriels et moteurs impliqués dans différents modèles d’expression de gène de facteur neurotrophique et d’autres processus biologiques, affectant la régénération de nerf. La présente étude a établi un protocole pour obtenir des SCs et des fibroblastes hautement purifiés de rat sensoriels et moteurs plus rapidement. La racine ventrale (nerf moteur) et la racine dorsale (nerf sensoriel) des rats néonatals (7 jours) ont été dissociées et les cellules ont été cultivées pendant 4-5 jours, suivies par l’isolement des fibroblastes sensoriels et moteurs et des SC en combinant la digestion différentielle et les méthodes d’adhérence différentiellement. Les résultats des analyses d’immunocytochimie et de cytométrie de flux ont montré que la pureté des SC et des fibroblastes sensoriels et moteurs était de >90%. Ce protocole peut être utilisé pour obtenir un grand nombre de fibroblastes sensoriels et moteurs / SC plus rapidement, contribuant à l’exploration de la régénération sensorielle et motrice des nerfs.
Introduction
Dans le système nerveux périphérique, les fibres nerveuses se composent principalement d’axones, de cellules Schwann (SC) et de fibroblastes, et contient également un petit nombre de macrophages, de cellules endothéliales microvasculaires et de cellules immunitaires1. Les SC enveloppent les axones dans un rapport de 1:1 et sont entourés d’une couche de tissu conjonctif appelée endoneurium. Les axones sont ensuite regroupés pour former des groupes appelés fascicles, et chaque fascicle est enveloppé dans une couche de tissu conjonctif connue sous le nom de périneurium. Enfin, la fibre nerveuse entière est enveloppée dans une couche de tissu conjonctif, qui est appelé l’épineurium. Dans l’endoneurium, la population cellulaire entière est composée de 48% SC, et une partie substantielle des cellules restantes implique des fibroblastes2. En outre, les fibroblastes sont des composants importants de tous les compartiments nerveux, y compris l’épineurium, le périneurium, et l’endoneurium3. De nombreuses études ont indiqué que les SC et les fibroblastes jouent un rôle crucial dans le processus de régénération après les lésions nerveuses périphériques4,5,6. Après la transection du nerf périphérique, les fibroblastes périneuriaux régulent le tri cellulaire par l’intermédiaire de la voie de signalisation ephrin-B/Ephb2 entre les SC et les fibroblastes, guidant davantage la repousse axonale à travers les blessures5. Les fibroblastes périphériques de nerf sécrètent la protéine de tenascine-C et améliorent la migration des SC pendant la régénération de nerf par la voie de signalisation β1-intégrine7. Cependant, les SC et les fibroblastes utilisés dans les études ci-dessus ont été dérivés du nerf sciatique, qui inclut les nerfs sensoriels et moteurs.
Dans le système nerveux périphérique, les nerfs sensoriels (nerfs afférents) conduisent la signalisation sensorielle des récepteurs au système nerveux central (SNC), tandis que les nerfs moteurs (nerfs efferents) conduisent des signaux du SNC aux muscles. Des études antérieures ont indiqué que les SC expriment des phénotypes moteurs et sensoriels distincts et sécrètent des facteurs neurotrophiques pour soutenir la régénération périphérique du nerf8,9. Selon une étude récente, les fibroblastes expriment également différents phénotypes moteurs et sensoriels et affectent la migration des SC10. Ainsi, l’exploration des différences entre les fibroblastes/SC des nerfs moteurs et sensoriels nous permet d’étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents complexes de la régénération spécifique du nerf périphérique.
À l’heure actuelle, il existe de nombreuses façons de purifier les SC et les fibroblastes, y compris l’application d’agents antimitotiques, cytolyse à médiation d’anticorps11,12, immunopanning séquentiel13 et laminine substrat14. Cependant, toutes les méthodes ci-dessus éliminent les fibroblastes et ne préservent que les SC. Les SC et les fibroblastes hautement purifiés peuvent être obtenus par la technologie de tri de cytométrie de flux15, mais c’est une technique longue et coûteuse. Ainsi, dans cette étude, une simple méthode de digestion différentielle et d’adhérence différentielle pour purifier et isoler les fibroblastes et les SC des nerfs sensoriels et moteurs a été développée afin d’obtenir un grand nombre de fibroblastes et de SC plus rapidement.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les deux principales populations cellulaires de nerfs périphériques comprenaient les SC et les fibroblastes. Les fibroblastes et SC principalement cultivés peuvent aider avec précision à modéliser la physiologie des fibroblastes et des SC pendant le développement et la régénération des nerfs périphériques. L’étude a montré que les cellules nerveuses sciatiques de rat P7 contenaient environ 85% des SC S100-positifs, 13% des fibroblastes OX7-positifs et seulement 1,5% des macrophages OX42-positifs<sup class…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été soutenue par le National Key Research and Development Program of China (Grant No. 2017YFA0104703), la National Natural Foundation of China (Grant No. 31500927).
Materials
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Life Technologies | A11005 | Dilution: 1:400 |
| CoraLite488-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Proteintech | SA00013-1 | Dilution: 1:400 |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| Cell Quest software | Becton Dickinson Biosciences | ||
| D-Hank's balanced salt solution | Gibco | 14170112 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ2-ILST | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099-141C | |
| Forskolin | Sigma | F6886-10MG | |
| Fluoroshield Mounting Medium | Abcam | ab104135 | |
| Fixation medium/Permeabilization medium | Multi Sciences (LIANKE) Biotech, Co., LTD | GAS005 | |
| Flow cytometry | Becton Dickinson Biosciences | FACS Calibur | |
| Mouse IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) – Isotype Control | Abcam | ab106163 | Dilution: 1:400 |
| Mouse monoclonal anti-CD90 antibody | Abcam | ab225 | Dilution: 1:1000 for ICC, 0.1 µg for 106 cells for Flow Cyt |
| Mouse anti-S100 antibody | Abcam | ab212816 | Dilution: 1:400 |
| Polylysine (PLL) | Sigma | P4832 | |
| Recombinant Human NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 EGF Domain Protein | R&D Systems | 396-HB-050 | |
| 0.25% (w/v) trypsin | Gibco | 25200-072 |
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