体外における感覚神経と運動神経からの線維芽細胞およびシュワン細胞の精製
Summary
ここでは、インビトロで感覚神経および運動神経から線維芽細胞およびシュワン細胞を精製する方法を提示する。
Abstract
末梢神経系の主な細胞は、シュワン細胞(SC)および線維芽細胞である。これらの細胞は、神経栄養因子遺伝子発現および他の生物学的プロセスの異なるパターンに関与する感覚および運動表現型を明確に発現し、神経再生に影響を与える。本研究は、高度に精製されたラット感覚および運動SCおよび線維芽細胞をより迅速に得るためのプロトコルを確立した。新生児ラットの腹根(運動神経)と後根(感覚神経)を解離し、細胞を4〜5日間培養し、続いて分化消化と微分付着法を組み合わせて感覚と運動線維芽細胞とSCを分離した。免疫細胞化学とフローサイトメトリー分析の結果、感覚および運動SCおよび線維芽細胞の純度は90%であった。このプロトコルは、多数の感覚および運動線維芽細胞/SCをより迅速に得るために使用することができ、感覚神経および運動神経再生の探索に寄与する。
Introduction
末梢神経系において、神経線維は主に軸索、シュワン細胞(SC)、および線維芽細胞から成り、また、少数のマクロファージ、微小血管内皮細胞、および免疫細胞1を含む。SCは軸索を1:1の比率で包み、エンドニウリウムと呼ばれる結合組織層で囲まれている。その後、軸索を束ねて、ファシクルと呼ばれるグループを形成し、各魅惑は、ペリネリウムとして知られている結合組織層に包まれます。最後に、神経線維全体が、上気圧と呼ばれる結合組織の層に包まれる。このエンドヌリウムでは、全細胞集団は48%のSCで構成され、残りの細胞の大部分は線維芽細胞2を含む。さらに、線維芽細胞は、上聴神経、会陰、および末端3を含むすべての神経区画の重要な構成要素である。多くの研究は、SCおよび線維芽細胞が末梢神経損傷44、5、65後の再生プロセスにおいて重要な役割を果たすことを6示している。末梢神経の切除後、胸部線維芽細胞は、SCと線維芽細胞との間のシグナル伝達経路を介して細胞の並べ替えを調節し、さらに創傷5を通して軸索再成長を導く。末梢神経線維芽細胞は、テナシン-Cタンパク質を分泌し、β1-インテグリンシグナル伝達経路7を介して神経再生中のSCの移動を増強する。しかし、上記の研究で使用されたSCおよび線維芽細胞は、感覚神経と運動神経の両方を含む坐骨神経に由来した。
末梢神経系では、感覚神経(知覚神経)は受容体から中枢神経系(CNS)への感覚シグナル伝達を行い、運動神経(神経)はCNSから筋肉への信号を行う。これまでの研究では、SCは、末梢神経再生,8,9を支持する明確な運動および感覚表現型および分泌神経栄養因子を発現することが示されている。最近の研究によると、線維芽細胞はまた、異なる運動および感覚表現型を発現し、SCs10の移動に影響を与える。このように、運動神経線維芽細胞と感覚神経線維芽細胞/SCの違いを探ると、末梢神経特異的再生の複雑な分子機構を研究することができます。
現在のところ、SCおよび線維芽細胞を精製する方法は多数あり、抗ミトキ薬の適用、抗体媒介性細胞分解11、12、,12シーケンシャルイムノパンニング13およびラミニン皮層14を含む14。しかし、上記の方法はすべて線維芽細胞を除去し、SCのみを保存する。高度に精製されたSCおよび線維芽細胞は、フローサイトメトリー選別技術15によって得ることができるが、それは時間とコストのかかる技術である。そこで本研究では、多数の線維芽細胞やSCをより迅速に得るために、感覚および運動神経線維芽細胞およびSCを精製・単離するための単純な微分消化および微分付着法が開発された。
Protocol
Representative Results
Discussion
末梢神経の2つの主要な細胞集団には、SCおよび線維芽細胞が含まれていた。主に培養された線維芽細胞およびSCは、末梢神経の発達および再生の間に線維芽細胞およびSCの生理学を正確にモデル化するのを助けることができる。この研究は、P7ラット坐骨神経細胞がS100陽性SCの約85%、OX7陽性線維芽細胞の13%、OX42陽性マクロファージ13の1.5%しか含まれていないことを示した。線…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国国家主要研究開発プログラム(グラント2017YFA0104703)、中国国立自然財団(グラント31500927)によって支援されました。
Materials
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Life Technologies | A11005 | Dilution: 1:400 |
| CoraLite488-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Proteintech | SA00013-1 | Dilution: 1:400 |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| Cell Quest software | Becton Dickinson Biosciences | ||
| D-Hank's balanced salt solution | Gibco | 14170112 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ2-ILST | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099-141C | |
| Forskolin | Sigma | F6886-10MG | |
| Fluoroshield Mounting Medium | Abcam | ab104135 | |
| Fixation medium/Permeabilization medium | Multi Sciences (LIANKE) Biotech, Co., LTD | GAS005 | |
| Flow cytometry | Becton Dickinson Biosciences | FACS Calibur | |
| Mouse IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) – Isotype Control | Abcam | ab106163 | Dilution: 1:400 |
| Mouse monoclonal anti-CD90 antibody | Abcam | ab225 | Dilution: 1:1000 for ICC, 0.1 µg for 106 cells for Flow Cyt |
| Mouse anti-S100 antibody | Abcam | ab212816 | Dilution: 1:400 |
| Polylysine (PLL) | Sigma | P4832 | |
| Recombinant Human NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 EGF Domain Protein | R&D Systems | 396-HB-050 | |
| 0.25% (w/v) trypsin | Gibco | 25200-072 |
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