Summary

Purificazione dei fibroblasti e delle cellule di Schwann dai nervi sensoriali e motori in Vitro

Published: May 20, 2020
doi:

Summary

Qui, presentiamo un metodo per purificare i fibroblasti e le cellule di Schwann dai nervi sensoriali e motori in vitro.

Abstract

Le cellule principali del sistema nervoso periferico sono le cellule di Schwann (SC) e i fibroblasti. Entrambe queste cellule esprimono distintamente i fenotipi sensoriali e motori coinvolti in diversi modelli di espressione genica del fattore neurotrofico e altri processi biologici, che influenzano la rigenerazione dei nervi. Il presente studio ha stabilito un protocollo per ottenere più rapidamente SC e fibroblasti di ratti altamente purificati e motori. La radice ventrale (nervo motore) e la radice dorsale (nervo sensoriale) dei ratti neo-cicliali (7 giorni) sono state dissociate e le cellule sono state coltivate per 4-5 giorni, seguite dall’isolamento dei fibroblasti sensoriali e motori e delle SC combinando in sequenza metodi differenziali di digestione e aderenza differenziale. I risultati delle analisi di immunocitochimica e citometria di flusso hanno mostrato che la purezza delle SC e dei fibroblasti sensoriali e motori era >90%. Questo protocollo può essere utilizzato per ottenere un gran numero di fibroblasti/SC sensoriali e motori, contribuendo all’esplorazione della rigenerazione del nervo sensoriale e motorio.

Introduction

Nel sistema nervoso periferico, le fibre nervose sono costituite principalmente da assoni, cellule di Schwann (SC) e fibroblasti, e contiene anche un piccolo numero di macrofagi, cellule endoteliali microvascolari e cellule immunitarie1. Le SC avvolgono gli assoni in un rapporto 1:1 e sono racchiuse da uno strato di tessuto connettivo chiamato endoneurium. Gli assoni vengono poi raggruppati insieme per formare gruppi chiamati fascicle, e ogni fascicolo è avvolto in uno strato di tessuto connettivo noto come perineurium. Infine, l’intera fibra nervosa è avvolta in uno strato di tessuto connettivo, che è chiamato l’epineurium. Nell’endoneurium, l’intera popolazione cellulare è composta da 48% SC, e una parte sostanziale delle cellule rimanenti coinvolge fibroblasti2. Inoltre, i fibroblasti sono componenti importanti di tutti i compartimenti nervosi, tra cui l’epineurium, il perineurium e l’endoneurium3. Molti studi hanno indicato che SC e fibroblasti svolgono un ruolo cruciale nel processo di rigenerazione dopo le lesioni nervose periferiche4,5,6. Dopo la transezione del nervo periferico, i fibroblasti perineuriali regolano lo smistamento delle cellule attraverso il percorso di segnalazione ephrin-B/EphB2 tra SC e fibroblasti, guidando ulteriormente la ricrescita assonale attraverso le ferite5 . I fibroblasti nervosi periferici secernono la proteina tenascina-C e migliorano la migrazione delle SC durante la rigenerazione dei nervi attraverso il percorso di segnalazione dell’integrazione diz1 7. Tuttavia, le SC e i fibroblasti utilizzati negli studi di cui sopra sono stati derivati dal nervo sciatico, che include nervi sensoriali e motori.

Nel sistema nervoso periferico, i nervi sensoriali (nervi afferenti) conducono segnali sensoriali dai recettori al sistema nervoso centrale (SNC), mentre i nervi motori (nervi efferenti) conducono segnali dal SNC ai muscoli. Studi precedenti hanno indicato che le Ccs esprimono fenotipi motori e sensoriali distinti e secernono fattori neurotrofici per sostenere la rigenerazione del nervo periferico8,9. Secondo un recente studio, i fibroblasti esprimono anche diversi fenotipi motori e sensoriali e influenzano la migrazione delle SC10. Pertanto, l’esplorazione delle differenze tra fibroblasti nervosi motori e sensoriali/SC ci permette di studiare i complicati meccanismi molecolari sottostanti della rigenerazione specifica del nervo periferico.

Attualmente, ci sono molti modi per purificare Le SC e i fibroblasti, tra cui l’applicazione di agenti antimitotici, citolisi mediata da anticorpi11,12, immunopanning sequenziale13 e substrato di laminina14. Tuttavia, tutti i metodi di cui sopra rimuovono i fibroblasti e conservano solo le SCs. SCs altamente purificate e i fibroblasti possono essere ottenuti con la tecnologia di selezione della citometria di flusso15, ma è una tecnica che richiede tempo e denaro. Quindi, in questo studio, è stata sviluppata una semplice digestione differenziale e un metodo di aderenza differenziale per purificare e isolare i fibroblasti nervosi sensoriali e motori e le SC al fine di ottenere un gran numero di fibroblasti e SC più rapidamente.

Protocol

Questo studio è stato effettuato in conformità con le Linee guida istituzionali per la cura degli animali dell’Università di Nantong. Tutte le procedure, compresi i soggetti animali, sono state approvate eticamente dal Comitato di Amministrazione degli Animali Sperimentali, provincia di Jiangsu, Cina. 1. Isolamento e coltura di fibroblasti nervosi motori e sensoriali e SC Usa i ratti Sprague-Dawley (SD) di sette giorni forniti dal Centro Sperimentale degli Animali della Nantong Un…

Representative Results

Osservazione microscopica leggeraLe SC e i fibroblasti sono le due principali popolazioni di cellule ottenute nella coltura cellulare primaria dai tessuti nervosi. Dopo l’inoculazione per 1 h, la maggior parte delle cellule ha aderito al fondo del piatto e la morfologia cellulare è cambiata da rotonda a ovale. Dopo la coltura per 24 h, le SCs hanno esibito una morfologia bipolare o tripolare e la lunghezza di questi variava da 100 a 200 m. Dopo 48 h, si è verificata…

Discussion

Le due principali popolazioni cellulari di nervi periferici includevano SC e fibroblasti. I fibroblasti e le SC coltivati principalmente possono aiutare con precisione a modellare la fisiologia di fibroblasti e SC durante lo sviluppo e la rigenerazione dei nervi periferici. Lo studio ha mostrato che le cellule nervose sciatiche di ratti P7 contenevano circa l’85% degli SC S100 positivi, il 13% dei fibroblasti positivi a OX7 e solo l’1,5% dei macrofagi oX42 positivi13. Anche se il numero di fibrobl…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo studio è stato sostenuto dal National Key Research and Development Program of China (Grant No. 2017YFA0104703), dalla National Natural Foundation of China (Grant n. 31500927).

Materials

Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG(H+L) Life Technologies A11005 Dilution: 1:400
CoraLite488-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L) Proteintech SA00013-1 Dilution: 1:400
Confocal laser scanning microscope Leica Microsystems TCS SP5
Cell Quest software Becton Dickinson Biosciences
D-Hank's balanced salt solution Gibco 14170112
DMEM Corning 10-013-CV
Dissecting microscope Olympus SZ2-ILST
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 10099-141C
Forskolin Sigma F6886-10MG
Fluoroshield Mounting Medium Abcam ab104135
Fixation medium/Permeabilization medium Multi Sciences (LIANKE) Biotech, Co., LTD GAS005
Flow cytometry Becton Dickinson Biosciences FACS Calibur
Mouse IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) – Isotype Control Abcam ab106163 Dilution: 1:400
Mouse monoclonal anti-CD90 antibody Abcam ab225 Dilution: 1:1000 for ICC, 0.1 µg for 106 cells for Flow Cyt
Mouse anti-S100 antibody Abcam ab212816 Dilution: 1:400
Polylysine (PLL) Sigma P4832
Recombinant Human NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 EGF Domain Protein R&D Systems 396-HB-050
0.25% (w/v) trypsin Gibco 25200-072

References

  1. Stierli, S., et al. The regulation of the homeostasis and regeneration of peripheral nerve is distinct from the CNS and independent of a stem cell population. Development (The Company of Biologists). , (2018).
  2. Schubert, T., Friede, R. L. The role of endoneurial fibroblasts in myelin degradation. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 40 (2), 134-154 (1981).
  3. Dreesmann, L., Mittnacht, U., Lietz, M., Schlosshauer, B. Nerve fibroblast impact on Schwann cell behavior. European Journal of Cell Biology. 88 (5), 285-300 (2009).
  4. Lavdas, A. A., et al. Schwann cells engineered to express the cell adhesion molecule L1 accelerate myelination and motor recovery after spinal cord injury. Experimental Neurology. 221 (1), 206-216 (2010).
  5. Parrinello, S., et al. EphB signaling directs peripheral nerve regeneration through Sox2-dependent Schwann cell sorting. Cell. 143 (1), 145-155 (2010).
  6. Benito, C., Davis, C. M., Gomez-Sanchez, J. A. STAT3 Controls the Long-Term Survival and Phenotype of Repair Schwann Cells during Nerve Regeneration. Journal of Neuroscience Research. 37 (16), 4255-4269 (2017).
  7. Zhang, Z. J., Jiang, B. C., Gao, Y. J. Chemokines in neuron-glial cell interaction and pathogenesis of neuropathic pain. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (18), 3275-3291 (2017).
  8. Hoke, A., et al. Schwann cells express motor and sensory phenotypes that regulate axon regeneration. Journal of Neuroscience. 26 (38), 9646-9655 (2006).
  9. Brushart, T. M., et al. Schwann cell phenotype is regulated by axon modality and central-peripheral location, and persists in vitro. Experiment Neurology. 247, 272-281 (2013).
  10. He, Q., et al. Differential Gene Expression in Primary Cultured Sensory and Motor Nerve Fibroblasts. Frontiers in Neuroscience. 12, 1016 (2018).
  11. Weinstein, D. E., Wu, R. Chapter 3, Unit 17: Isolation and purification of primary Schwann cells. Current Protocols in Neuroscience. , (2001).
  12. Palomo Irigoyen, M., et al. Isolation and Purification of Primary Rodent Schwann Cells. Methods in Molecular Biology. 1791, 81-93 (2018).
  13. Cheng, L., Khan, M., Mudge, A. W. Calcitonin gene-related peptide promotes Schwann cell proliferation. Journal of Cell Biology. 129 (3), 789-796 (1995).
  14. Pannunzio, M. E., et al. A new method of selecting Schwann cells from adult mouse sciatic nerve. Journal of Neuroscience Methods. 149 (1), 74-81 (2005).
  15. Shen, M., Tang, W., Cao, Z., Cao, X., Ding, F. Isolation of rat Schwann cells based on cell sorting. Molecular Medicine Reports. 16 (2), 1747-1752 (2017).
  16. He, Q., Man, L., Ji, Y., Ding, F. Comparison in the biological characteristics between primary cultured sensory and motor Schwann cells. Neuroscience Letters. 521 (1), 57-61 (2012).
  17. Weiss, T., et al. Proteomics and transcriptomics of peripheral nerve tissue and cells unravel new aspects of the human Schwann cell repair phenotype. Glia. 64 (12), 2133-2153 (2016).

Play Video

Cite This Article
He, Q., Yu, F., Li, Y., Sun, J., Ding, F. Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro. J. Vis. Exp. (159), e60952, doi:10.3791/60952 (2020).

View Video