Fibroblastların ve Schwann Hücrelerinin İn vitro duyusal ve motor sinirlerden arındırması
Summary
Burada, fibroblastlar ve Schwann hücrelerini in vitro olarak duyusal ve motor sinirlerden arındırmak için bir yöntem salıyoruz.
Abstract
Periferik sinir sistemindeki başlıca hücreler Schwann hücreleri (SCs) ve fibroblastlardır. Her iki hücre de sinir rejenerasyonunu etkileyen nörotrofik faktör gen ekspresyonu ve diğer biyolojik süreçlerin farklı desenlerinde yer alan duyusal ve motor fenotipleri belirgin bir şekilde ifade eder. Bu çalışma, yüksek oranda saflaştırılmış sıçan duyusal ve motor SC’leri ve fibroblastları daha hızlı elde etmek için bir protokol oluşturmuştur. Yenidoğan sıçanlarının ventral kökü (motor sinir) ve dorsal kökü (duyusal sinir) ayrıştırıldı ve hücreler 4-5 gün boyunca kültürlendi, ardından ayırıcı sindirim ve diferansiyel yapışma yöntemlerini sırayla birleştirerek duyusal ve motor fibroblastlar ve SC’lerin izolasyonu yapıldı. İmmünositokimya ve akış sitometrisi analizlerinin sonuçları duyusal ve motor SC’lerin ve fibroblastların saflığının %gt;90 olduğunu gösterdi. Bu protokol duyusal ve motor sinir rejenerasyonu keşfine katkıda, duyusal ve motor fibroblastlar / SCs çok sayıda elde etmek için kullanılabilir.
Introduction
Periferik sinir sisteminde, sinir lifleri esas olarak akson oluşur, Schwann hücreleri (SCs), ve fibroblastlar, ve aynı zamanda makrofajlar az sayıda içerir, mikrovasküler endotel hücreleri, ve bağışıklık hücreleri1. SC’ler aksonlar1:1 oranında sarılır ve endoneurium adı verilen bağ dokusu tabakası ile çevrilidir. Aksonlar daha sonra fasikül adı verilen gruplar oluşturmak için bir araya toplanır ve her fasikül perineurium olarak bilinen bir bağ dokusu tabakasına sarılır. Son olarak, tüm sinir lifi bağ dokusu bir tabaka sarılır, hangi epineurium olarak denir. Endoneurium’da, tüm hücre popülasyonu %48’lik SC’lerden oluşur ve kalan hücrelerin2önemli bir kısmı fibroblastlar 2’dir. Ayrıca, fibroblastlar epineurium, perineurium ve endoneurium3dahil olmak üzere tüm sinir kompartmanlarının önemli bileşenleridir. Birçok çalışma, SCs ve fibroblastlar periferik sinir yaralanmaları sonra rejenerasyon sürecinde önemli bir rol oynadığını göstermiştir4,5,6. Periferik sinirin ranzeksiyonundan sonra, perineurial fibroblastlar SC’ler ve fibroblastlar arasındaki efrin-B/EphB2 sinyal yolu üzerinden hücre sıralamasını düzenler, yaralar la aksonal yeniden büyümeye rehberlik eder5. Periferik sinir fibroblastları tenascin-C proteini salgılar ve β1-integrin sinyalyolu7 ile sinir rejenerasyonu sırasında SC’lerin göçünü artırır. Ancak, yukarıdaki çalışmalarda kullanılan SCs ve fibroblastlar siyatik sinir türetilmiştir, hangi duyusal ve motor sinirler hem de içerir.
Periferik sinir sisteminde, duyusal sinirler (afferent sinirler) merkezi sinir sistemi (CNS) reseptörlerinden duyusal sinyal yapmak, motor sinirler (efferent sinirler) kaslara CNS sinyalleri ilerlerken. Önceki çalışmalar, SCs farklı motor ve duyusal fenotipler ifade ve periferik sinir rejenerasyon desteklemek için nörotrofik faktörler salgılargöstermiştir 8,9. Yakın tarihli bir araştırmaya göre, fibroblastlar da farklı motor ve duyusal fenotipler ifade ve SCs göç etkiler10. Böylece, motor ve duyusal sinir fibroblastları/SC’leri arasındaki farkların araştırılması, periferik sinir spesifik rejenerasyonunun karmaşık altta yatan moleküler mekanizmalarını incelememizi sağlar.
Şu anda, antimitotik ajanların uygulanması da dahil olmak üzere, SCs ve fibroblastlar arındırmak için birçok yolu vardır, antikor aracılı sitoz11,12, sıralı immünpanning13 ve laminin substratum14. Ancak, yukarıdaki tüm yöntemler fibroblastlar kaldırmak ve sadece SCs korumak. Yüksek saflaştırılmış SCs ve fibroblastlar akış sitometri sıralama teknolojisi15elde edilebilir , ama zaman alıcı ve pahalı bir tekniktir. Bu nedenle, bu çalışmada, duyusal ve motor sinir fibroblastları ve SC’leri daha hızlı bir şekilde elde etmek için basit bir diferansiyel sindirim ve diferansiyel bağlılık yöntemi geliştirilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Periferik sinirlerin iki büyük hücre popülasyonları SCs ve fibroblastlar dahil. Öncelikle kültürlü fibroblastlar ve SCs doğru periferik sinir gelişimi ve rejenerasyon sırasında fibroblastlar ve SCs fizyolojisi modelleme yardımcı olabilir. Çalışma, P7 sıçan siyatik sinir hücrelerinin S100-pozitif SC’lerin yaklaşık %85’ini, OX7-pozitif fibroblastların %13’ünü ve OX42-pozitif makrofajların sadece %1,5’ini13’üiçerdiğini göstermiştir. Fibroblast ların sayısı SC’lerden…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (Grant No. 2017YFA0104703), Çin Ulusal Doğal Vakfı (Grant No. 31500927) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Life Technologies | A11005 | Dilution: 1:400 |
| CoraLite488-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Proteintech | SA00013-1 | Dilution: 1:400 |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| Cell Quest software | Becton Dickinson Biosciences | ||
| D-Hank's balanced salt solution | Gibco | 14170112 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ2-ILST | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099-141C | |
| Forskolin | Sigma | F6886-10MG | |
| Fluoroshield Mounting Medium | Abcam | ab104135 | |
| Fixation medium/Permeabilization medium | Multi Sciences (LIANKE) Biotech, Co., LTD | GAS005 | |
| Flow cytometry | Becton Dickinson Biosciences | FACS Calibur | |
| Mouse IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) – Isotype Control | Abcam | ab106163 | Dilution: 1:400 |
| Mouse monoclonal anti-CD90 antibody | Abcam | ab225 | Dilution: 1:1000 for ICC, 0.1 µg for 106 cells for Flow Cyt |
| Mouse anti-S100 antibody | Abcam | ab212816 | Dilution: 1:400 |
| Polylysine (PLL) | Sigma | P4832 | |
| Recombinant Human NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 EGF Domain Protein | R&D Systems | 396-HB-050 | |
| 0.25% (w/v) trypsin | Gibco | 25200-072 |
References
- Stierli, S., et al. The regulation of the homeostasis and regeneration of peripheral nerve is distinct from the CNS and independent of a stem cell population. Development (The Company of Biologists). , (2018).
- Schubert, T., Friede, R. L. The role of endoneurial fibroblasts in myelin degradation. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 40 (2), 134-154 (1981).
- Dreesmann, L., Mittnacht, U., Lietz, M., Schlosshauer, B. Nerve fibroblast impact on Schwann cell behavior. European Journal of Cell Biology. 88 (5), 285-300 (2009).
- Lavdas, A. A., et al. Schwann cells engineered to express the cell adhesion molecule L1 accelerate myelination and motor recovery after spinal cord injury. Experimental Neurology. 221 (1), 206-216 (2010).
- Parrinello, S., et al. EphB signaling directs peripheral nerve regeneration through Sox2-dependent Schwann cell sorting. Cell. 143 (1), 145-155 (2010).
- Benito, C., Davis, C. M., Gomez-Sanchez, J. A. STAT3 Controls the Long-Term Survival and Phenotype of Repair Schwann Cells during Nerve Regeneration. Journal of Neuroscience Research. 37 (16), 4255-4269 (2017).
- Zhang, Z. J., Jiang, B. C., Gao, Y. J. Chemokines in neuron-glial cell interaction and pathogenesis of neuropathic pain. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (18), 3275-3291 (2017).
- Hoke, A., et al. Schwann cells express motor and sensory phenotypes that regulate axon regeneration. Journal of Neuroscience. 26 (38), 9646-9655 (2006).
- Brushart, T. M., et al. Schwann cell phenotype is regulated by axon modality and central-peripheral location, and persists in vitro. Experiment Neurology. 247, 272-281 (2013).
- He, Q., et al. Differential Gene Expression in Primary Cultured Sensory and Motor Nerve Fibroblasts. Frontiers in Neuroscience. 12, 1016 (2018).
- Weinstein, D. E., Wu, R. Chapter 3, Unit 17: Isolation and purification of primary Schwann cells. Current Protocols in Neuroscience. , (2001).
- Palomo Irigoyen, M., et al. Isolation and Purification of Primary Rodent Schwann Cells. Methods in Molecular Biology. 1791, 81-93 (2018).
- Cheng, L., Khan, M., Mudge, A. W. Calcitonin gene-related peptide promotes Schwann cell proliferation. Journal of Cell Biology. 129 (3), 789-796 (1995).
- Pannunzio, M. E., et al. A new method of selecting Schwann cells from adult mouse sciatic nerve. Journal of Neuroscience Methods. 149 (1), 74-81 (2005).
- Shen, M., Tang, W., Cao, Z., Cao, X., Ding, F. Isolation of rat Schwann cells based on cell sorting. Molecular Medicine Reports. 16 (2), 1747-1752 (2017).
- He, Q., Man, L., Ji, Y., Ding, F. Comparison in the biological characteristics between primary cultured sensory and motor Schwann cells. Neuroscience Letters. 521 (1), 57-61 (2012).
- Weiss, T., et al. Proteomics and transcriptomics of peripheral nerve tissue and cells unravel new aspects of the human Schwann cell repair phenotype. Glia. 64 (12), 2133-2153 (2016).
