טיהור של פיברותקיעות ותאי Schwann מפני חושים ומוטוריים עצבים בחוץ גופית
Summary
כאן, אנו מציגים שיטה כדי לטהר את התאים הסרטניים ואת תאי Schwann מפני חושים ועצבים מוטוריים בתוך מבחנה.
Abstract
התאים העיקריים במערכת העצבים ההיקפית הם התאים של Schwann (ה scs) והפיברותקיעות. שני תאים אלה בבירור לבטא את הפנוטיפים חושי ומוטוריים מעורבים דפוסים שונים של ביטוי גנים neurotrophic factor ותהליכים ביולוגיים אחרים, המשפיעים על התחדשות העצב. המחקר הנוכחי הקים פרוטוקול כדי לקבל מאוד מטוהרים חושי החולדה ה scs מנוע ופיברותקיעות במהירות רבה יותר. השורש הגחוני (העצב המוטורי) והשורש הגבי (העצב החושי) של עכברי התרבות הבין-מלאכותית (שבעה ימים) היו מוטטים והתאים היו מתורבתים במשך 4-5 ימים, ואחריו בידוד של מנועי החישה והה scs על-ידי שילוב העיכול הדיפרנציאלי ושיטות הדבקות הדיפרנציאליות התוצאות של מנתח האימונוציטוכימיה והזרימה cyה scs try הראו כי הטוהר של החושים וה מוטוריים ופיברותקיעות היו > 90%. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לקבל מספר רב של החושים מוטוריים פיברותקיעות/ה scs במהירות רבה יותר, לתרום לחקר של התחדשות החושים ומוטורית.
Introduction
במערכת העצבים ההיקפית, סיבי העצב מורכב בעיקר axons, התאים Schwann (ה scs), ופיברופיצוצים, וכן מכיל מספר קטן של מקרופאגים, תאי מיקרוכלי-דם אנדותל, ותאים חיסוניים1. ה scs לעטוף את האקסונים ביחס 1:1 ומוקפים בשכבת רקמת חיבור הנקראת endoneתוריון. לאחר מכן, האקטונים מאוחדים יחד כדי ליצור קבוצות שנקראות פססיקלס, וכל פסלול עטוף בשכבת רקמת חיבור המכונה הנקבים. בסופו של דבר, סיבי העצב עטוף בשכבת רקמת חיבור, אשר נקראת בתור הקולטן. ב-endoneurium כל אוכלוסיית התאים מורכבת מ-48% ה scs, וחלק ניכר מהתאים הנותרים כרוך בפיברותקיעות2. יתר על כן, הפיברובדורים הם מרכיבים חשובים של כל תאי העצב, כולל הפריאנארייון, הנקבים, והאניוניון3. מחקרים רבים ציינו כי ה scs ו פיברותקיעות לשחק תפקיד מכריע בתהליך התחדשות לאחר פציעות4עצביםהיקפית 4,5,6. לאחר רוחבי של עצב היקפי, הperineurial פיברופיצוצים להסדיר מיון התא באמצעות המסלול האפור-B/EphB2 איתות בין ה scs ופיברותקיעות, עוד המנחה את לצמיחה מחודשת סיבי באמצעות פצעים5. עצבי היקפי להפריש החלבון tenascin-C חלבונים ולשפר את הגירה של ה scs במהלך התחדשות העצב באמצעות β1-אינטגרציה איתות מסלול7. עם זאת, הה scs והפיברוטים המשמשים במחקרים שלעיל נגזרו מעצב הירך, הכולל הן חושים ועצבים מוטוריים.
במערכת העצבים ההיקפית, העצבים הסנסוריים (עצבי הגוף) מבצעים איתות חושי מן הקולטנים למערכת העצבים המרכזית (CN), בעוד העצבים המוטוריים (efferent עצבים) מבצעים אותות מתוך ה-CN אל השרירים. מחקרים קודמים הראו כי ה scs express מוטורית ופנוטיפים מוטוריים וחושים ומפרישות neurotrophic גורמים כדי לתמוך התחדשות היקפית עצביים8,9. על פי מחקר שנערך לאחרונה, פיברופיצוצים גם לבטא פנוטיפים מוטוריים וחושים שונים ולהשפיע על הגירה של ה scs10. כך, החקירה של הבדלים בין המנוע העצבי החושי פיברותקיעות/ה scs מאפשר לנו ללמוד את המנגנונים המורכבים הבסיסיים הבסיסית של התחדשות העצב ההיקפית הסגולי.
כיום, ישנן דרכים רבות כדי לטהר ה scs ופיברופיצוצים, כולל היישום של antimitotic סוכנים, נוגדן-תיווך cytolysis11,12, הimmunopanning סדרתי13 ו-למינציה ב-טקטי תשתית14. עם זאת, כל השיטות הנ ל להסיר את הפיברוכדורים ולשמר רק את ה scs. ה scs מאוד מטוהרים ופיברותקיעות ניתן להשיג על ידי הזרמת cy, לנסות מיון טכנולוגיה15, אבל זה זמן רב ויקר טכניקה. מכאן, במחקר זה, העיכול הדיפרנציאלי פשוטה ושיטת הדבקות הדיפרנציאליות לטיהור ובידוד החושים והעצבים המוטוריים והה scs פותחה על מנת להשיג מספר רב של פיברותקיעות וה scs במהירות רבה יותר.
Protocol
Representative Results
Discussion
שתי אוכלוסיות התאים המרכזיות של עצבי היקפי כללו ה scs ופיברופיצוצים. הפיברותקיעות בעיקר תרבותית ו ה scs יכול במדויק לסייע במידול הפיזיולוגיה של הפיברותקיעות ו ה scs במהלך פיתוח עצבי היקפי והתחדשות. המחקר הראה כי P7 בתאי עצב מבוססי עכברוש הכיל כ 85% של S100-חיוביים ה scs, 13% של OX7-חיוביים הפיברופיצוצים…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי תוכנית המחקר ופיתוח המפתח הלאומי של סין (גרנט No. 2017YFA0104703), הקרן הלאומית הטבעית של סין (גרנט No. 31500927).
Materials
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Life Technologies | A11005 | Dilution: 1:400 |
| CoraLite488-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Proteintech | SA00013-1 | Dilution: 1:400 |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| Cell Quest software | Becton Dickinson Biosciences | ||
| D-Hank's balanced salt solution | Gibco | 14170112 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ2-ILST | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099-141C | |
| Forskolin | Sigma | F6886-10MG | |
| Fluoroshield Mounting Medium | Abcam | ab104135 | |
| Fixation medium/Permeabilization medium | Multi Sciences (LIANKE) Biotech, Co., LTD | GAS005 | |
| Flow cytometry | Becton Dickinson Biosciences | FACS Calibur | |
| Mouse IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) – Isotype Control | Abcam | ab106163 | Dilution: 1:400 |
| Mouse monoclonal anti-CD90 antibody | Abcam | ab225 | Dilution: 1:1000 for ICC, 0.1 µg for 106 cells for Flow Cyt |
| Mouse anti-S100 antibody | Abcam | ab212816 | Dilution: 1:400 |
| Polylysine (PLL) | Sigma | P4832 | |
| Recombinant Human NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 EGF Domain Protein | R&D Systems | 396-HB-050 | |
| 0.25% (w/v) trypsin | Gibco | 25200-072 |
References
- Stierli, S., et al. The regulation of the homeostasis and regeneration of peripheral nerve is distinct from the CNS and independent of a stem cell population. Development (The Company of Biologists). , (2018).
- Schubert, T., Friede, R. L. The role of endoneurial fibroblasts in myelin degradation. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 40 (2), 134-154 (1981).
- Dreesmann, L., Mittnacht, U., Lietz, M., Schlosshauer, B. Nerve fibroblast impact on Schwann cell behavior. European Journal of Cell Biology. 88 (5), 285-300 (2009).
- Lavdas, A. A., et al. Schwann cells engineered to express the cell adhesion molecule L1 accelerate myelination and motor recovery after spinal cord injury. Experimental Neurology. 221 (1), 206-216 (2010).
- Parrinello, S., et al. EphB signaling directs peripheral nerve regeneration through Sox2-dependent Schwann cell sorting. Cell. 143 (1), 145-155 (2010).
- Benito, C., Davis, C. M., Gomez-Sanchez, J. A. STAT3 Controls the Long-Term Survival and Phenotype of Repair Schwann Cells during Nerve Regeneration. Journal of Neuroscience Research. 37 (16), 4255-4269 (2017).
- Zhang, Z. J., Jiang, B. C., Gao, Y. J. Chemokines in neuron-glial cell interaction and pathogenesis of neuropathic pain. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (18), 3275-3291 (2017).
- Hoke, A., et al. Schwann cells express motor and sensory phenotypes that regulate axon regeneration. Journal of Neuroscience. 26 (38), 9646-9655 (2006).
- Brushart, T. M., et al. Schwann cell phenotype is regulated by axon modality and central-peripheral location, and persists in vitro. Experiment Neurology. 247, 272-281 (2013).
- He, Q., et al. Differential Gene Expression in Primary Cultured Sensory and Motor Nerve Fibroblasts. Frontiers in Neuroscience. 12, 1016 (2018).
- Weinstein, D. E., Wu, R. Chapter 3, Unit 17: Isolation and purification of primary Schwann cells. Current Protocols in Neuroscience. , (2001).
- Palomo Irigoyen, M., et al. Isolation and Purification of Primary Rodent Schwann Cells. Methods in Molecular Biology. 1791, 81-93 (2018).
- Cheng, L., Khan, M., Mudge, A. W. Calcitonin gene-related peptide promotes Schwann cell proliferation. Journal of Cell Biology. 129 (3), 789-796 (1995).
- Pannunzio, M. E., et al. A new method of selecting Schwann cells from adult mouse sciatic nerve. Journal of Neuroscience Methods. 149 (1), 74-81 (2005).
- Shen, M., Tang, W., Cao, Z., Cao, X., Ding, F. Isolation of rat Schwann cells based on cell sorting. Molecular Medicine Reports. 16 (2), 1747-1752 (2017).
- He, Q., Man, L., Ji, Y., Ding, F. Comparison in the biological characteristics between primary cultured sensory and motor Schwann cells. Neuroscience Letters. 521 (1), 57-61 (2012).
- Weiss, T., et al. Proteomics and transcriptomics of peripheral nerve tissue and cells unravel new aspects of the human Schwann cell repair phenotype. Glia. 64 (12), 2133-2153 (2016).
