מודל ספרואיד תלת-ממדי לגלינובלסטומה
Summary
כאן, אנו מתארים שיטת פלישה קלה לשימוש עבור גלינובלסטומה. שיטת הפעולה הזאת מתאימה לתאים גלנובלסטומה כמו גזע. מאקרו של פיג’י לכימות קל של פלישה, הגירה והתפשטות מתואר גם כן.
Abstract
שתי ממדיות (2D) תרביות תאים לא לחקות את הגידול vivo בסדר משביע רצון. לכן, מודלים תלת ממדיים (3D) תרבות ספרואיד פותחו. מודלים אלה עשויים להיות חשובים במיוחד בתחום של נוירולוגיה-אונקולוגיה. אכן, גידולים במוח יש נטייה לפלוש לסביבת המוח הבריא. אנו מתארים זאת באופן אידיאלי 3d גליובלסטומה המבוססת על מבוססי שפיתחנו לחקור את הפלישה הגידול. אנו מספקים את כל הפרטים הטכניים והכלים האנליטיים כדי לבצע בהצלחה את השיטת העבודה.
Introduction
ברוב המחקרים באמצעות קווי תא ראשי או מסחרית, בחני מבוצעים על תאים שגדלו על משטחי פלסטיק כמו תרבויות דופלקס. ניהול תרבות התא ב-2D מייצג חסרונות, כפי שהוא אינו מחקה בסביבת תא vivo 3D. בתרבויות דו-ממדיות, כל משטח התא הוא ישירות במגע עם המדיום, שינוי צמיחת התאים ושינוי זמינות התרופה. יתר על כן, משטח פלסטיק לא פיזיולוגי מפעיל בידול תא1. מודלים תלת ממדיים של תרבות פותחו כדי להתגבר על הקשיים הללו. יש להם את היתרון של לחקות את האדריכלות הרב-תאיים ואת טרוגניות של גידולים2, ולכן יכול להיחשב למודל רלוונטי יותר עבור גידולים מוצק3. המבנה המורכב של הספרואידים תורם להערכה טובה יותר של חדירה לסמים והתנגדות4. הגידול טרוגניות ב ספרואיד משפיע על הדיפוזיה של חמצן וחומרים מזינים, ואת התגובה של סוכני תרופתי (איור 1A). דיפוזיה של חמצן משתנה כאשר גודל ספרואיד מגיע 300 μm, גרימת סביבה ארוי במרכז הספרואיד (איור 1A, C). מטבוליטים הם גם פחות חודר דרך שכבות התא והתגובות מטבולית לפצות להתרחש5. כאשר קוטרו של מגדיל ספרואיד, ליבות נקרוטיות ניתן לצפות, עוד מאפיינים לחקות המצויים בסוגי סרטן מוצק רבים, כולל סרטן המוח האגרסיבי גליובלסטומה (GBM)6.
מספר הפלישה 2d או 3d שאומר עבור gliנובלסטומה דווחו בספרות7,8. מימד דו-מימדי הם בעיקר לחקר הפלישה במישור אופקי על שכבת מטריצה דקה או בתוך שיטת הקאמרית Boyden9. תלת מימדי בחני שתוארו עם תרבויות תלת-ממד ספרואיד באמצעות קווי התאים הקלאסיים גליובלסטומה10. גרסאות מורכבות יותר מיוצגים על ידי פלישה של אורגנואידים המוח על ידי spheroids הגידול בתרבויות העימות11. עם זאת, עדיין חשוב לפתח שיטת קל לשימוש ושימוש בלתי זמין לכל מעבדה. פיתחנו פרוטוקול לייצר תאים של גזע גלנובלסטומה מדגימות המטופל. הקוונפיקציה של מספר אלה ניתן לניהול בקלות ודורשת רק תוכנה מקוונת גישה לפתוח. בקצרה, חתיכות הגידול הם חותכים לחתיכות קטנות מתעכל באמצעות אנזימטי. תאים בודדים הנגזרים מהעיכול מעובדים במדיום נוירו-בסיס. לאחר 4-7 ימים, מבנים ספרואיד יוצרים באופן ספונטני. עם השרשה הגולגולתית בדגמי עכברים, הם יוצרים גידולים המציגות ליבה נקרוטיק מוקפת בתאי מדומה-פאליפורם12. זה דומה מאוד למאפיינים המצויים בחולים GBM.
במאמר זה, אנו מתארים את הפרוטוקול שלנו כדי לייצר spheroids מתוך מספר נחוש של תאים כדי להבטיח התוכסות. ניתן להשתמש בשני מטריצות משלימות למטרה זו: מטריצות וסוג קולגן I. מטריצות מועשר בגורמי גדילה ומחקה את קרום המוח הבזתי הנדרש לתא המצורף והגירה. מצד שני, קולגן סוג אני, אלמנט מבנית של משתית, הוא הנפוץ ביותר fibrillary מטריקס מטריצה והוא משמש הפלישה התא assays. להלן, אנו ממחישים את המודל הספרואיד שלנו על-ידי ביצוע הגירה והפצת מוסר. ניתוח נעשה לא רק בנקודות בזמן קבוע אלא גם על ידי ניטור התרחבות ספרואיד ותנועת התאים על ידי הדמיה חיה. יתר על כן, המיקרוסקופיה אלקטרונית נעשתה כדי להמחיש פרטים מורפולוגיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הגידול ספרואיד בחני מותאמים היטב כדי ללמוד מאפייני הגידול כולל התפשטות, פלישה, הגירה, כמו גם מוות תאים ותגובת סמים. תאים סרטניים לפלוש מטריקס 3D ויוצרים גידול פולשני מיקרו, כפי שנראה באיור 4B, C. במהלך התהליך פולשנית, מטריצה מטאלואוטיות (MMP) לעכל מטריצות מסביב תאים סרט…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי Transcan 2017, ARC 2017, Ligue Contre הסרטן (הקומיא דה לה גירדה et דה לה Charente-ימית). Joris Guyon הוא מקבל התחברות מבית החולים באוניברסיטת טולוז (CHU טולוז).
Materials
| 96 well round-bottom plate | Falcon | 08-772-212 | |
| Accutase | Gibco | A11105-01 | Stored at 4 °C, sphere dissociation enzyme |
| B27 | Gibco | 12587 | Stored at -20 °C, defrost before use |
| Basic Fibroblast Growth Factor | Peprotech | 100-18B | Stored at -20 °C, defrost before use |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10283 | |
| DPBS 10X | Pan Biotech | P04-53-500 | Stored at 4 °C |
| Fiji software | ImageJ | Used to analyze pictures | |
| Flask 75 cm2 | Falcon | 10497302 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | Stored at -20 °C, diluted to a final concentration of 0.2 mg/mL in cold NBM |
| Methylcellulose | Sigma | M0512 | Diluted in NBM for a 2% final concentration |
| NBM | Gibco | 21103-049 | Stored at 4 °C |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | Stored at 4 °C |
| Penicillin – Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Stored at 4 °C |
| Trypan blue 0.4% | ThermoFisher | T10282 | Used to cell counting |
| Type I Collagen | Corning | 354236 | Stored at 4 °C |
References
- Pelissier, F. A., et al. Age-related dysfunction in mechanotransduction impairs differentiation of human mammary epithelial progenitors. Cell Reports. 7, 1926-1939 (2014).
- Ishiguro, T., et al. Tumor-derived spheroids: Relevance to cancer stem cells and clinical applications. Cancer Science. 108, 283-289 (2017).
- Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240, 177-184 (1988).
- Desoize, B., Jardillier, J. Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance?. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 36, 193-207 (2000).
- Corbet, C., Feron, O. Tumour acidosis: from the passenger to the driver’s seat. Nature Reviews Cancer. 17, 577-593 (2017).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148, 3-15 (2010).
- Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting. Journal of Visualized Experiments. (105), e53409 (2015).
- Cavaco, A. C. M., Eble, J. A. A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies. Journal of Visualized Experiments. (150), e60122 (2019).
- Boye, K., et al. The role of CXCR3/LRP1 cross-talk in the invasion of primary brain tumors. Nature Communications. 8, 1571 (2017).
- Dejeans, N., et al. Autocrine control of glioma cells adhesion and migration through IRE1alpha-mediated cleavage of SPARC mRNA. Journal of Cell Science. 125, 4278-4287 (2012).
- Golembieski, W. A., Ge, S., Nelson, K., Mikkelsen, T., Rempel, S. A. Increased SPARC expression promotes U87 glioblastoma invasion in vitro. International Journal of Developmental Neuroscience. 17, 463-472 (1999).
- Daubon, T., et al. Deciphering the complex role of thrombospondin-1 in glioblastoma development. Nature Communications. 10, 1146 (2019).
- Friedl, P., Wolf, K. Tube travel: the role of proteases in individual and collective cancer cell invasion. 암 연구학. 68, 7247-7249 (2008).
- Das, A., Monteiro, M., Barai, A., Kumar, S., Sen, S. MMP proteolytic activity regulates cancer invasiveness by modulating integrins. Scientific Reports. 7, 14219 (2017).
- Schaeffer, D., Somarelli, J. A., Hanna, G., Palmer, G. M., Garcia-Blanco, M. A. Cellular migration and invasion uncoupled: increased migration is not an inexorable consequence of epithelial-to-mesenchymal transition. Molecular and Cellular Biology. 34, 3486-3499 (2014).
- de Gooijer, M. C., Guillen Navarro, M., Bernards, R., Wurdinger, T., van Tellingen, O. An Experimenter’s Guide to Glioblastoma Invasion Pathways. Trends in Molecular Medicine. 24, 763-780 (2018).
- Daubon, T., et al. The invasive proteome of glioblastoma revealed by laser-capture microdissection. Neuro-Oncology Advances. 1 (1), vdz029 (2019).
