Glioblastoma için 3D Spheroid Model
Summary
Burada glioblastoma için kullanımı kolay bir istila çıktısını tanımlıyoruz. Bu töz glioblastoma kök benzeri hücreler için uygundur. İstilanın, göçün ve çoğalmanın kolay ölçülmesi için bir Fiji makrosu da tanımlanmıştır.
Abstract
İki boyutlu (2D) hücre kültürleri in vivo tümör büyümesini tatmin edici bir şekilde taklit etmez. Bu nedenle üç boyutlu (3D) kültür spheroid modelleri geliştirilmiştir. Bu modeller nöro-onkoloji alanında özellikle önemli olabilir. Gerçekten de, beyin tümörleri sağlıklı beyin ortamı işgal eğilimi var. Burada tümör invazyonunu incelemek için geliştirdiğimiz ideal 3Boyutlu glioblastoma spheroid tabanlı bir test tanımlıyoruz. Bu analizi başarıyla gerçekleştirmek için tüm teknik ayrıntıları ve analitik araçları salıyoruz.
Introduction
Birincil veya ticari olarak mevcut hücre hatları kullanılarak yapılan çalışmaların çoğunda, tahliller tek katmanlı kültürler olarak plastik yüzeylerde yetiştirilen hücreler üzerinde gerçekleştirilir. Hücre kültürünü n in vivo 3D hücre ortamını taklit etmediği için, hücre kültürünü 2B olarak yönetmek dezavantajları temsil eder. 2B kültürlerde, tüm hücre yüzeyi ortamla doğrudan temas halindedir, hücre büyümesini değiştirir ve ilaç bulunabilirliğini değiştirir. Ayrıca, fizyolojik olmayan plastik yüzey hücre farklılaşmasını tetikler1. Bu zorlukların üstesinden gelmek için üç boyutlu kültür modelleri geliştirilmiştir. Onlar tümörlerin çok hücreli mimarisi ve heterojenite taklit avantajı var2, ve böylece katı tümörler için daha uygun bir model olarak kabul edilebilir3. Küresel lerin karmaşık morfolojisi ilaç penetrans ve direnç4daha iyi değerlendirilmesine katkıda bulunur. Küresel tümör heterojenitesi oksijen ve besin lerin difüzyonunu ve farmakolojik ajanlara yanıtı etkiler (Şekil 1A). Küresel boyut 300 μm’ye ulaştığında oksijen difüzyonu değişir ve küreseloidin merkezinde hipoksik bir ortam ortaya çıkarır(Şekil 1A,C). Metabolitler de hücre tabakaları ile daha az nüfuz ve metabolik reaksiyonlar telafi5yer alır. Küresel çapı arttığında, nekrotik çekirdekler görülebilir, daha fazla taklit özellikleri birçok katı kanserlerde bulunan, agresif beyin kanseri glioblastoma dahil (GBM)6.
Glioblastom için birkaç 2D veya 3D invazyon tahlilleri literatürde bildirilmiştir7,8. İki boyutlu tahliller esas olarak ince bir matris tabakası üzerinde yatay bir düzlemde veya Boyden odası tahlil9işgali incelemek içindir. Klasik glioblastoma hücre hatları10kullanılarak 3Boyutlu spheroid kültürleri ile üç boyutlu tahliller tanımlanmıştır. Daha karmaşık varyantlar çatışma kültürleri11tümör spheroids tarafından beyin organoidlerin invazyonu ile temsil edilmektedir. Ancak, herhangi bir laboratuvar için kolay kullanımlı ve tekrarlanabilir bir test geliştirmek hala önemlidir. Hasta örneklerinden glioblastoma kök benzeri hücreler üretmek için bir protokol geliştirdik. Bu tahlillerin sayısallaştırılması kolayca yönetilebilir ve sadece açık erişimli çevrimiçi yazılım gerektirir. Kısaca, tümör parçaları küçük parçalar halinde kesilir ve enzimatik olarak sindirilir. Sindirimden elde edilen tek hücreler nörobazal ortamda yetiştirilir. 4-7 gün sonra küresel yapılar kendiliğinden oluşur. Fare modellerinde intrakranial implantasyon üzerine, psödo-palisading hücreleri ile çevrili bir nekrotik çekirdek sergileyen tümörler oluştururlar12. Bu, GBM hastalarında bulunan özelliklere çok benzer.
Bu makalede, tekrarlanabilirliği sağlamak için belirlenen sayıda hücreden küresel üreme protokolümüzü açıklıyoruz. Bu amaçla iki tamamlayıcı matris kullanılabilir: Matrigel ve kollajen tip I. Matrigel büyüme faktörleri ile zenginleştirilmiştir ve hücre bağlanması ve göçü için gerekli olan memeli bazal zarını taklit eder. Öte yandan, kollajen tip I, stroma yapısal bir unsur, en sık görülen fibrillary ekstrasellüler matriks ve hücre invazyon tahlillerinde kullanılır. Burada, göç ve proliferasyon tahlilleri yaparak GBM küresel modelimizi gösteriyoruz. Analiz sadece sabit zaman noktalarında değil, aynı zamanda canlı görüntüleme ile küresel genişleme ve hücre hareketi izleyerek yapıldı. Ayrıca morfolojik detayları görselleştirmek için elektron mikroskobu yapıldı.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tümör spheroid tahlilleri, proliferasyon, invazyon ve göçün yanı sıra hücre ölümü ve ilaç yanıtı gibi tümör özelliklerini incelemek için iyi adapte edilmiştir. Kanser hücreleri, Şekil 4B,C’degörüldüğü gibi invaziv bir mikrotümör oluşturan 3D matrisi istila eder. İnvaziv süreç sırasında, matriks metalloproteinazlar (MMP) tümör hücrelerini çevreleyen matrisleri sindirir13, ve MMP inhibitörleri (örneğin, GM6001 ve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Transcan 2017, ARC 2017, Ligue Contre le Cancer (Comité de la Gironde et de la Charente-Maritime) tarafından desteklenmiştir. Joris Guyon, Toulouse Üniversitesi Hastanesi’nden (CHU Toulouse) burs sahibidir.
Materials
| 96 well round-bottom plate | Falcon | 08-772-212 | |
| Accutase | Gibco | A11105-01 | Stored at 4 °C, sphere dissociation enzyme |
| B27 | Gibco | 12587 | Stored at -20 °C, defrost before use |
| Basic Fibroblast Growth Factor | Peprotech | 100-18B | Stored at -20 °C, defrost before use |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10283 | |
| DPBS 10X | Pan Biotech | P04-53-500 | Stored at 4 °C |
| Fiji software | ImageJ | Used to analyze pictures | |
| Flask 75 cm2 | Falcon | 10497302 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | Stored at -20 °C, diluted to a final concentration of 0.2 mg/mL in cold NBM |
| Methylcellulose | Sigma | M0512 | Diluted in NBM for a 2% final concentration |
| NBM | Gibco | 21103-049 | Stored at 4 °C |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | Stored at 4 °C |
| Penicillin – Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Stored at 4 °C |
| Trypan blue 0.4% | ThermoFisher | T10282 | Used to cell counting |
| Type I Collagen | Corning | 354236 | Stored at 4 °C |
References
- Pelissier, F. A., et al. Age-related dysfunction in mechanotransduction impairs differentiation of human mammary epithelial progenitors. Cell Reports. 7, 1926-1939 (2014).
- Ishiguro, T., et al. Tumor-derived spheroids: Relevance to cancer stem cells and clinical applications. Cancer Science. 108, 283-289 (2017).
- Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240, 177-184 (1988).
- Desoize, B., Jardillier, J. Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance?. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 36, 193-207 (2000).
- Corbet, C., Feron, O. Tumour acidosis: from the passenger to the driver’s seat. Nature Reviews Cancer. 17, 577-593 (2017).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148, 3-15 (2010).
- Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting. Journal of Visualized Experiments. (105), e53409 (2015).
- Cavaco, A. C. M., Eble, J. A. A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies. Journal of Visualized Experiments. (150), e60122 (2019).
- Boye, K., et al. The role of CXCR3/LRP1 cross-talk in the invasion of primary brain tumors. Nature Communications. 8, 1571 (2017).
- Dejeans, N., et al. Autocrine control of glioma cells adhesion and migration through IRE1alpha-mediated cleavage of SPARC mRNA. Journal of Cell Science. 125, 4278-4287 (2012).
- Golembieski, W. A., Ge, S., Nelson, K., Mikkelsen, T., Rempel, S. A. Increased SPARC expression promotes U87 glioblastoma invasion in vitro. International Journal of Developmental Neuroscience. 17, 463-472 (1999).
- Daubon, T., et al. Deciphering the complex role of thrombospondin-1 in glioblastoma development. Nature Communications. 10, 1146 (2019).
- Friedl, P., Wolf, K. Tube travel: the role of proteases in individual and collective cancer cell invasion. 암 연구학. 68, 7247-7249 (2008).
- Das, A., Monteiro, M., Barai, A., Kumar, S., Sen, S. MMP proteolytic activity regulates cancer invasiveness by modulating integrins. Scientific Reports. 7, 14219 (2017).
- Schaeffer, D., Somarelli, J. A., Hanna, G., Palmer, G. M., Garcia-Blanco, M. A. Cellular migration and invasion uncoupled: increased migration is not an inexorable consequence of epithelial-to-mesenchymal transition. Molecular and Cellular Biology. 34, 3486-3499 (2014).
- de Gooijer, M. C., Guillen Navarro, M., Bernards, R., Wurdinger, T., van Tellingen, O. An Experimenter’s Guide to Glioblastoma Invasion Pathways. Trends in Molecular Medicine. 24, 763-780 (2018).
- Daubon, T., et al. The invasive proteome of glioblastoma revealed by laser-capture microdissection. Neuro-Oncology Advances. 1 (1), vdz029 (2019).
