神経膠芽腫の3次元スフェロイドモデル
Summary
ここでは、神経膠芽腫に対する使いやすい侵入アッセイについて述べています。このアッセイは、神経膠芽腫幹細胞に適しています。侵略、移動、および拡散を容易に定量化するためのフィジーのマクロも説明されています。
Abstract
二次元(2D)細胞培養は生体内腫瘍増殖を良好に模倣しない。そこで、3次元(3D)培養スフェロイドモデルが開発された。これらのモデルは、神経腫瘍学の分野で特に重要である可能性があります。確かに、脳腫瘍は健康な脳環境に侵入する傾向があります。我々は、腫瘍の浸潤を研究するために開発した理想的な3D神経膠芽腫スフェロイドベースのアッセイをここに記載する。このアッセイを成功させるために、技術的な詳細と分析ツールをすべて提供しています。
Introduction
一次または市販の細胞株を用いたほとんどの研究では、単層培養物としてプラスチック表面上で増殖した細胞に対してアッセイが行われる。2Dで細胞培養を管理することは、生体内3D細胞環境を模倣しないため、欠点を表します。2D培養では、細胞表面全体が培地に直接接触し、細胞の成長を変化させ、薬物の入手可能性を改変する。さらに、非生理学的プラスチック表面は細胞分化をトリガする1。これらの困難を克服するために三次元の文化モデルが開発されました。彼らは腫瘍2の多細胞アーキテクチャと異質性を模倣するという利点を有し、したがって、固形腫瘍3のより関連性の高いモデルであると考えることができる。スフェロイドの複雑な形態は、薬物浸透および耐性をより良く評価するのに寄与する。スフェロイドにおける腫瘍不均一性は、酸素および栄養素の拡散に影響を及ぼし、薬理学的薬剤に対する応答を示す(図1A)。スフェロイドサイズが300μmに達すると酸素の拡散が変化し、スフェロイドの中心に低酸素環境を誘導する(図1A、C)。代謝産物はまた、細胞層を通して浸透が少なく、代謝反応を補償する5が起こる。スフェロイドの直径が大きくなると、壊死コアが観察され、積極的な脳癌神経膠芽腫(GBM)6を含む多くの固形癌に見られる更なる模倣6特性が観察される。
神経膠芽腫に関するいくつかの2Dまたは3Dの浸潤アッセイが文献77,88で報告されている。二次元アッセイは、主に薄いマトリックス層の水平面またはボイデンチャンバーアッセイ9での侵略を研究するためのものである。三次元アッセイは、古典的な神経膠芽腫細胞株10を用いた3Dスフェロイド培養液で記載されている。より複雑な変異体は、対立培養11における腫瘍スフェロイドによる脳オルガノイドの侵入によって表される。しかし、どんな研究室でも使いやすく再現可能なアッセイを開発することは、依然として重要です。我々は、患者のサンプルから神経膠芽腫幹細胞を生成するプロトコルを開発した。これらのアッセイの定量化は容易に管理可能であり、オープンアクセスオンラインソフトウェアだけを必要とする。簡単に言えば、腫瘍片を小さく切り、酵素的に消化する。消化から誘導される単一細胞は、神経基底培地で培養される。4〜7日後、スフェロイド構造は自発的に形成される。マウスモデルで頭蓋内移植を行う際に、擬似接触形成細胞12に囲まれた壊死コアを示す腫瘍を形成する。これは、GBM患者に見られる特性によく似ています。
この記事では、再現性を確保するために、特定の数のセルからスフェロイドを生成するプロトコルについて説明します。この目的には、マトリゲルとコラーゲンタイプI.Matrigelが増殖因子に富み、細胞の取り付けと移動に必要な哺乳類の基底膜を模倣する2つの相補行列を使用できます。一方、間質の構造要素であるコラーゲンタイプIは、最も一般的な線維体細胞外マトリックスであり、細胞浸潤アッセイに使用されています。本明細書において、我々は、移行および増殖アッセイを行うことにより、我々のGBMスフェロイドモデルを説明する。解析は、固定された時点だけでなく、ライブイメージングによるスフェロイド膨張と細胞の動きを監視することによっても行った。さらに、電子顕微鏡検査を行い、形態学的詳細を可視化した。
Protocol
Representative Results
Discussion
腫瘍スフェロイドアッセイは、増殖、浸潤、および移動、ならびに細胞死および薬物応答を含む腫瘍特性を研究するのに適している。癌細胞は、図4B,Cに見られるように、侵襲的な微小腫瘍を形成する3Dマトリックスに侵入する。侵襲的プロセス中、マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)は、腫瘍細胞13を取り囲むマトリックスを消化し、M…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、トランスカン2017、ARC 2017、リーグ・コントル・ル・ガン(コミテ・ド・ラ・ジロンド・エ・ド・ラ・シャラント・マリタイム)によってサポートされました。ジョリス・ギヨンはトゥールーズ大学病院(CHUトゥールーズ)からフェローシップを受けています。
Materials
| 96 well round-bottom plate | Falcon | 08-772-212 | |
| Accutase | Gibco | A11105-01 | Stored at 4 °C, sphere dissociation enzyme |
| B27 | Gibco | 12587 | Stored at -20 °C, defrost before use |
| Basic Fibroblast Growth Factor | Peprotech | 100-18B | Stored at -20 °C, defrost before use |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10283 | |
| DPBS 10X | Pan Biotech | P04-53-500 | Stored at 4 °C |
| Fiji software | ImageJ | Used to analyze pictures | |
| Flask 75 cm2 | Falcon | 10497302 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | Stored at -20 °C, diluted to a final concentration of 0.2 mg/mL in cold NBM |
| Methylcellulose | Sigma | M0512 | Diluted in NBM for a 2% final concentration |
| NBM | Gibco | 21103-049 | Stored at 4 °C |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | Stored at 4 °C |
| Penicillin – Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Stored at 4 °C |
| Trypan blue 0.4% | ThermoFisher | T10282 | Used to cell counting |
| Type I Collagen | Corning | 354236 | Stored at 4 °C |
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