Un modelo de esferoides 3D para Glioblastoma

Summary

Aquí, describimos un ensayo de invasión fácil de usar para el glioblastoma. Este ensayo es adecuado para células similares al glioblastoma similares a un tallo. También se describe una macro de Fiji para cuantificar fácilmente la invasión, la migración y la proliferación.

Abstract

Los cultivos celulares bidimensionales (2D) no imitan satisfactoriamente el crecimiento tumoral in vivo. Por lo tanto, se desarrollaron modelos de esferoides de cultivo tridimensionales (3D). Estos modelos pueden ser particularmente importantes en el campo de la neurooncología. De hecho, los tumores cerebrales tienen la tendencia a invadir el ambiente cerebral sano. Aquí describimos un ensayo ideal basado en esferoides de glioblastoma 3D que desarrollamos para estudiar la invasión tumoral. Proporcionamos todos los detalles técnicos y herramientas analíticas para realizar con éxito este ensayo.

Introduction

En la mayoría de los estudios que utilizan líneas celulares primarias o disponibles comercialmente, los ensayos se realizan en células cultivadas en superficies plásticas como cultivos monocapa. La gestión del cultivo celular en 2D representa desventajas, ya que no imita un entorno de células 3D in vivo. En los cultivos 2D, toda la superficie celular está directamente en contacto con el medio, alterando el crecimiento celular y modificando la disponibilidad de medicamentos. Además, la superficie de plástico no fisiológico desencadena la diferenciación celular¹. Se han desarrollado modelos de cultivo tridimensionalparados para superar estas dificultades. Tienen la ventaja de imitar la arquitectura multicelular y la heterogeneidad de los tumores^2,por lo que podrían considerarse un modelo más relevante para los tumores sólidos^3. La compleja morfología de los esferoides contribuye a evaluar mejor la penetración y resistencia a los fármacos^4. La heterogeneidad tumoral en el esferoide afecta a la difusión de oxígeno y nutrientes, y la respuesta a los agentes farmacológicos(Figura 1A). La difusión del oxígeno se altera cuando el tamaño de los esferoides alcanza los 300 m, induciendo un ambiente hipoxico en el centro del esferoide(Figura 1A,C). Los metabolitos también son menos penetrantes a través de las capas celulares y las reacciones metabólicas compensatorias tienen lugar⁵. Cuando aumenta el diámetro de la esferoide, se pueden observar núcleos necróticos, imitando aún más las características encontradas en muchos cánceres sólidos, incluyendo el glioblastoma agresivo del cáncer cerebral (GBM)⁶.

Varios ensayos de invasión 2D o 3D para el glioblastoma se han divulgado en la literatura^7,8. Los ensayos bidimensionales son principalmente para estudiar la invasión en un plano horizontal en una capa de matriz delgada o en un ensayo de cámara Boyden^9. Los ensayos tridimensionales se han descrito con cultivos de esferoides 3D utilizando líneas celulares clásicas de glioblastoma^10. Variantes más complejas están representadas por la invasión de organoides cerebrales por esferoides tumorales en las culturas de confrontación^11. Sin embargo, sigue siendo importante desarrollar un ensayo fácil de usar y reproducible disponible para cualquier laboratorio. Hemos desarrollado un protocolo para generar células similares a glioblastoma a partir de muestras de pacientes. La cuantificación de estos ensayos es fácilmente manejable y sólo requiere software en línea de acceso abierto. Brevemente, las piezas tumorales se cortan en trozos pequeños y se digieren enzimáticamente. Las células individuales derivadas de la digestión se cultivan en medio neurobasal. Después de 4-7 días, las estructuras esferoides se forman espontáneamente. Tras la implantación intracraneal en modelos de ratones, forman tumores que exhiben un núcleo necrótico rodeado de células pseudo-palisading^12. Esto se asemeja mucho a las características encontradas en los pacientes con GBM.

En este artículo, describimos nuestro protocolo para producir esferoides a partir de un número determinado de celdas para garantizar la reproducibilidad. Para ello se pueden utilizar dos matrices complementarias: Matrigel y colágeno tipo I. Matrigel se enriquece en factores de crecimiento e imita la membrana basal de mamíferos necesaria para la unión celular y la migración. Por otro lado, el colágeno tipo I, un elemento estructural del estroma, es la matriz extracelular fibrilar más común y se utiliza en ensayos de invasión celular. Aquí, ilustramos nuestro modelo de esferoides GBM mediante la realización de ensayos de migración y proliferación. El análisis se realizó no sólo en puntos de tiempo fijos, sino también mediante el monitoreo de la expansión del esferoide y el movimiento celular mediante imágenes en vivo. Además, la microscopía electrónica se realizó para visualizar detalles morfológicos.

Protocol

Se obtuvo el consentimiento por escrito informado de todos los pacientes (del Hospital Haukeland, Bergen, Noruega de acuerdo con las regulaciones del comité de ética local). Nuestro protocolo sigue las pautas del comité de ética de investigación humana de nuestra institución. 1. Generación de esferoides tumorales de tamaño uniforme NOTA: Las células similares al tallo se cultivan en medio neurobasal complementado con suplemento B27, heparina, FGF-2, penicilin…

Representative Results

Los esferoides se prepararon como se describe en la sección de protocolos y se hicieron observaciones con respecto a la migración, invasión, proliferación y microscopía. Para medir la hipoxia en áreas distintas de la estructura esférica, se utilizó la tinción de anhidrasa IX carboxínica para determinar la actividad hipoxica(Figura 1A-C). Se observaron más células CAIX positivas en el centro esferoide(Figura 1<…

Discussion

Los ensayos con esferoides tumorales están bien adaptados para estudiar las características tumorales, incluida la proliferación, la invasión y la migración, así como la muerte celular y la respuesta a las drogas. Las células cancerosas invaden la matriz 3D formando un microtumor invasivo, como se ve en la Figura 4B,C. Durante el proceso invasivo, las matrices de digestión de la matriz de metaloproteinasas (MMP) que rodean las células tumorales^13</…

Materials

96 well round-bottom plate	Falcon	08-772-212
Accutase	Gibco	A11105-01	Stored at 4 °C, sphere dissociation enzyme
B27	Gibco	12587	Stored at -20 °C, defrost before use
Basic Fibroblast Growth Factor	Peprotech	100-18B	Stored at -20 °C, defrost before use
Countess Cell Counting Chamber Slides	Invitrogen	C10283
DPBS 10X	Pan Biotech	P04-53-500	Stored at 4 °C
Fiji software	ImageJ		Used to analyze pictures
Flask 75 cm2	Falcon	10497302
Matrigel	Corning	354230	Stored at -20 °C, diluted to a final concentration of 0.2 mg/mL in cold NBM
Methylcellulose	Sigma	M0512	Diluted in NBM for a 2% final concentration
NBM	Gibco	21103-049	Stored at 4 °C
Neurobasal medium	Gibco	21103049	Stored at 4 °C
Penicillin – Streptomycin	Gibco	15140-122	Stored at 4 °C
Trypan blue 0.4%	ThermoFisher	T10282	Used to cell counting
Type I Collagen	Corning	354236	Stored at 4 °C