본 간행물은 성숙한 지방세포로부터 핵의 분리, 형광 활성화 선별에 의한 정제, 및 단세포 수준 전사학에 대한 프로토콜을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
갈색과 베이지 색 지방은 UCP1 (분리 단백질-1)에 의해 열발생에 대한 에너지를 발산하는 특수 조직 조직입니다 의존적이고 독립적 인 경로. 최근까지 열발생 성 지방 세포는 균일 한 인구로 간주되었다. 그러나, 최근 연구는 발달 기원, 기판 사용 및 전사에서 구별되는 다중 특수형 또는 하위 집단이 있다는 것을 표시했습니다. 단세포 유전체학의 진보에도 불구하고, 지방 분조직의 비편향분해는 지질이 채워진 지방세포의 연약한 특성 때문에 도전적이다. 제시된 프로토콜은 RNA 시퀀싱을 포함하여 다운스트림 응용을 위한 지방 조직에서 단 하나 핵의 효과적인 격리에 의해 이 장애물을 우회하기 위하여 개발되었습니다. 세포 이질성은 RNA 시퀀싱 및 생물정보 분석에 의해 분석될 수 있다.
서론
연구 에 따르면 갈색 지방 조직 (BAT)은 에너지를 분산시키는 놀라운 능력을 가지고 있습니다. 설치류와 인간 모두에서 뚜렷한 발달 기능을 갖춘 두 가지 유형의 열성 선포세포가 존재합니다: 베이지 색 지방 세포와 고전적인 갈색 지방세포. 고전적인 갈색 지방세포는 주로 중간 형 BAT 창고에 위치하지만, 베이지 색 지방 세포는 만성 감기 노출과 같은 특정 생리적 단서에 대한 응답으로 흰색 지방 조직 (WAT)에서 산발적으로 나타난다, 과정은 "브라우닝" 또는 "베이깅"으로 지칭되는 과정. 고급 이미징의 사용을 통해, 성인 인간은 UCP1+ BAT의 상당한 창고를 가지고 있음을 지금 분명하다, 특히 supraclavicular 영역1,,2,,3,,4. 성인 인간의 BAT의 양은 반대로 사도와 상관 관계가 있으며 만성 감기 노출5,,6 또는 β3-adrenergic 수용체고뇌7과같은 외부 단서에 의해 증가....
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프로토콜
알버트 아인슈타인 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 된 절차에 따라 동물 관리 및 실험이 수행되었습니다.
1. 조직 소화 및 리시스 완충제 준비
- 조직 소화 버퍼를 준비합니다.
- 지방 조직의 모든 그램에 대해 ~ 1 mL의 소화 버퍼를 준비하십시오.
- 1.5 U/mL 콜라게나아제 D 와 2.4 U/mL 디스파제 II를 계량하고 인산염 완충식식염수(PBS)를 추가합니다.
- 핵 준비 버퍼(NPB)를 준비한다.
- 10m HEPES, 1.5 mM MM 염화 마그네슘, 염화 10m 칼륨, 250mM 자당, 뉴클레아제 없는 물에서 0.1% NP-40을 준비한다. 잘 섞으세요. 자당은 다른 성분보다 용해하는 데 더 많은 시간이 걸릴 수 있습니다.
- 0.5% 소 세럼 알부민(BSA) 용액을 준비한다.
- EDTA를 포함하는 PBS에서 0.5%의 BSA를 준비합니다. 멸균 여과 된 세포 배양 등급 PBS를 사용하는 것이 좋습니다 (재료표참조).
2. 지방 조직의 효소 소화
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결과
분류되지 않은 세포 핵에는 다운스트림 단세포 RNA 염기서열분석에서 소음과 높은 배경을 생성하는 이물질과 이중핵이 포함되어 있습니다. 대표적인 FACS 게이트 전략은 그림 1에표시됩니다. 핵은 먼저 전방 분산(FSC) 및 측면 산란(SSC)(A)에 기초하여 선택된 다음, SSC(B)의 폭과 높이의 조합에 기초하여 단일만 선택되었다.AB 마지막으로 DAPI 양수 이벤트만 선택되어 컬렉션버퍼(C)로정렬되었습니다. 이 워크플로우는 핵 응집체 및 세포 이물질을 최소화한 고도로 정제된 단일 핵을제공한다(그림 2).
선별된 핵의 무결성을 확인하기 위해 DAPI 염색 후 현미경으로.......
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토론
단일 핵을 분리하고 지방 조직 이질성을 연구하는 간단하고 견고한 방법이 제시됩니다. 전체 조직 RNA 시퀀싱에 비해,이 워크플로우는 세포 이질성 및 인구 별 마커의 편견보기를 제공합니다. 이것은 지방 세포 생물학, 분자 대사 및 비만 연구의 발전을 위해 중요하고 혁신적입니다.
이 프로토콜은 특히 snRNA-seq의 다운스트림 응용 프로그램에 최적화되어 있습니다. MoFlo XDP 고속 선별기로 건강한 핵을 격리하는 "정리" 단계는 핵 멤브레인 무결성을 유지하면서 원유 서스펜션에서 이물질과 골재를 완전히 제거합니다. 따라서, 이것은 액적 형성에 있는 포획 효율을 증가하고 검출된 유전자의 수의 손실 없이 단 1개의 실행에서 단 하나 핵 전사의 수천을 복구합니다. 조사된 단일 핵 또는 세포의 더 높은 수를 제공하는 물방울 계 단일 세포 플랫폼 외에도, 선별기 계 마이크로플레이트 및 유동성 C1플랫폼(15)은 전.......
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공개 사항
저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
감사의 글
우리는 알버트 아인슈타인 유전체학 코어에서 데이비드 레이놀즈와 기술 지원을위한 흐름 사이토메트리 코어에서 징항 장 감사드립니다. 우리는 국립 보건원 (NIH) (DK110426) 및 아인슈타인 마운트 시나이 당뇨병 연구 센터 (DK020541) 및 뉴욕 비만 연구 센터 (DK026687)의 파일럿 및 타당성 보조금 (K.S.에 모두)의 지원을 인정합니다. 우리는 또한 핵심 지원에 대한 알버트 아인슈타인 암 센터 (CA013330)에 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| autoMACS 헹굼 솔루션 | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | PBS with EDTA; 멸균 여과 |
| BSA | Sigma | A1595 | |
| CaCl2 | Sigma | 21115 | |
| 셀 필터 100 μ m | 코닝 | 431752 | |
| 셀 필터 40μ m | 코닝 | 431750 | |
| CellTrics (30 μ m) | Sysmex | 04-004-2326 | |
| 콜라겐 분해 효소 D | Roche | 11088866001 | |
| Countess II FL 자동 세포 계수기 | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| DAPI | 시그마 | D9542 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| HEPES | 시그마 | H4034 | |
| KCl | Fisher | P217-3 | |
| MACS 스마트 스트레이너(30 & 마이크로; m) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | 스택형 필터 |
| MgCl2 | Sigma | M1028 | |
| MoFloXDP 세포 분류기 | Beckman Coulter | ML99030 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Protector RNase 억제제 | Roche | 3335402001 | |
| Sucrose | Fisher | S5-3 |
참고문헌
- Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1509-1517 (2009).
- van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in....
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재인쇄 및 허가
