이 프로토콜은 수백 개의 미생물 세포에 대한 AFM 측정을 자동화하는 것을 목표로합니다. 첫째, 미생물은 PDMS 스탬프 미세 구조로 고정된 다음 수백 개의 고정된 세포에서 분광법 측정이 자동으로 수행됩니다.
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방법 논문
수백 개의 알비칸스 세포에 대한 생체 원자력 현미경 측정 자동화
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이 논문에서
요약
초록
이 논문에 제시된 방법은 Bio-AFM 실험과 힘 곡선 의 기록을 자동화하는 것을 목표로 합니다. 이 방법을 사용하면 4시간 만에 1000셀의 힘 곡선을 자동으로 기록할 수 있습니다. 4시간 분석 시간을 유지하려면 셀당 힘 곡선 수가 9 또는 16으로 줄어듭니다. 이 방법은 Jython 기반 프로그램과 정의된 패턴에 셀을 조립하는 전략을 결합합니다. 상용 Bio-AFM에 구현된 이 프로그램은 어레이의 첫 번째 셀에 있는 팁을 중앙에 누친 다음 각 셀의 힘 곡선을 기록하는 동안 셀에서 셀로 자동으로 이동할 수 있습니다. 이 방법론을 이용하여, 그들의 강성, 그들의 접착 특성 등과 같은 세포의 생물물리학적 파라미터에 접근할 수 있다. 자동화 와 많은 수의 세포가 분석되면 세포 집단의 동작에 접근할 수 있습니다. 이것은 데이터가 있는 Bio-AFM 필드에 있는 돌파구입니다, 지금까지, 단지 수십개의 세포에 기록되었습니다.
서론
이 작품은 원자력 현미경 (AFM)을 사용하여 살아있는 세포의 수백에 자동 힘 측정을 수행하는 방법론을 제공합니다. 또한 액체 환경에서 수행된 AFM 실험과 호환되는 PDMS 미세 구조화 스탬프에 미생물을 고정하는 방법을 제공한다.
Bio-AFM은 생물학 응용을 위해 잉태된 다음 살아있는 세포를 연구하는 데 사용되는 고도로 전문화된 기술입니다. 그것은 시간에 하나의 셀을 분석 할 수있는 숙련 된 엔지니어가 필요합니다. 이러한 조건에서, 분석될 수 있는 상이한 세포의 수는 4-5시간 안에 오히려 작고, 전형적인 5-10세포이다. 그러나 단일 셀에 기록된 힘 측정의 양은 일반적으로 매우 높으며 쉽게 1000에 도달 할 수 있습니다. 따라서, 살아있는 세포에 대한 AFM 힘 측정의 현재 패러다임은 수백 개의 힘 곡선(FC)을 기록하지만 제한된 수의 세포에 기록된다.
통계적으로, 이 접근은 의심스럽고, 견본의 대표성의 문제를 제기합니다. 실제로, 예를 들어, 수백 개의 측정이 이 몇몇 세포에 기록되더라도, 단지 몇몇 세포를 측정하여 세포 집단의 이질성을 평가하는 것은 어렵습니다. 그러나, 생물물리학, 미생물학 및 나노의학1,2,
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프로토콜
1. 미생물 세포 배양
- 글리세롤 육수에서 세포를 되살리십시오.
참고 : C. 알비칸은 구슬에 글리세롤 주식 -80 °C에 저장됩니다.- -80°C 스톡에 대리석을 선택하고 효모 펩톤 덱스트로스(YPD) 한천에 문지릅니다. 액체 재배 전에 30 °C에서 2 일 동안 세포를 성장시면 됩니다.
- 액체 배양을 준비합니다.
- 멸균 YPD 국물의 5mL배양튜브를 채우고 YPD 한천판에서 자란 C. 알비칸스 세포의 단일 식민지를 추가한다.
- 원심분리(4000 x g,5분)로 수확하기 전에 20시간 동안 30°C에서 정전기 조건에서 배양을 늘린다. 상체를 버리고 생물 위험 폐기물로 제거하십시오.
- 아세테이트 버퍼 10mL로 펠릿 2x를 세척하십시오(8mM 아세테이트, 1mM CaCl2,1mM MnCl2,pH 5.2). 심분리기 (4000 x g,5 분) 세탁 사이에.
- 아세테이트 버퍼2mL에서 펠릿을 다시 중단하고 PDMS 스탬프의 세포 고정을 위해 이 솔루션을 사용합니다.
참고: 이 서스펜션은 저장할 수 없으며 섹션 3에 대해 새로 준비해야 합니다. ....
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결과
우리는 야영형 인간 병원체 C. 알비칸의 생물학적 특성에 대한 카포핑인의 효과를 분석하기 위해 설명된 프로토콜을 사용했다. Caspofungin는 다른 약물 때문에 항진균 세포를 향해 개발 하는 저항 메커니즘의 효과가 있을 때 사용 되는 마지막 기회 항진균 분자. 그것의 작용 기전은 ß 글루칸 합성을 담당하는 복잡한 fks1/Fks2의 서브유닛 Fks2의 억제에 기초한다. ß 글루칸은 곰팡이세포벽(16,17)의주요 성분이기 때문에, 우리는 세포벽의 생물학적 특성의 변형을 기대했다: 강성 및 접착.
도 6은 위에 제시된 모든 프로토콜이 적용될 때 얻어진 전형적인 히스토그램을 제시한다. 적색 히스토그램은 957개의 네이티브 셀에 기록된 강성 재분할을 나타내고 574캐스포풍 처리된 세포에 대한 파란색 세포를 나타.......
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토론
이 방법론에서 제공하는 주요 개선사항은 측정된 시간 단위로 측정된 세포의 수가 현저한 증가입니다. 대응은 셀당 측정된 점수의 감소입니다. 즉, 이 방법은 단일 셀에 대한 자세한 분석을 제공하도록 설계되지 않았습니다. 이 방법은 PDMS 스탬프의 우물에 들어갈 수 있는 셀에만 적용됩니다. 스탬프는 매우 다재다능하며, 1.5 x 1.5 μm2최대 6 x 6 μm 2의 우물을 포함하고있습니다. 여전히 간균 이나 훨씬 더 큰 세포를 고정 하는 것은 불가능. 스탬프와 모세관 대류 증착은 훨씬 더 큰 포유류 세포 (길이 약 100 μm)를 고정하는 데 사용할 수 없습니다.
이러한 맥락에서, Peric외. 19는 대장균 과 간균 subtilis 같이 간균을 고정하기 위하여 똑똑한 미세유체 장치를 개발했습니다. 이 장치는 정의된 위치와 생리학적 조건하에서 간균을 고정할 수 있게 합.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
우리는 CONACYT (멕시코), 프랑스 외무부및 유니버시테 파리 13의 FONCYCYT를 인정하고 싶습니다, 국제 협력 ECOS-NORD 프로젝트의 재정 지원하지만 진단나노-palpation, No. 263337 (멕시코) 및 MI5P02 (프랑스). AMR은 프로젝트 No. 20195489 통해 SIP-IPN의 재정 지원에 감사드립니다. SPC는 COtutelle 계약을 통해 CONACYT(no. 288029)와 IPN의 박사 학위 펠로우십에 의해 지원되며, 이중 박사 학위(IPN-UPS)를 획득합니다. ED와 CFD는 센터 내셔널 드 라 레체르체 시엔티피크 (CNRS)의 연구원입니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| AFM 캔틸레버 | Bruker AFM 프로브 | MLCT | 사용된 캔틸레버는 " C” 7-10 kHz 및 k의 공진 주파수 : 0.01 N / m |
| AFM 데이터 분석 | JPK-Bruker | JPK 데이터 처리 버전 최소 5.1.8 | JPK-Bruker 사용자 계정에서 다운로드 할 수 있습니다 |
| AFM 페트리 접시 | WPI | FluoroDish FD35-100 | 히터는 실험 중 온도 변화를 모니터링하는 데 사용되었습니다 |
| 원자력 현미경 (AFM) | JPK-Bruker | Nanowizard II 또는 III | AFM은 전동 스테이지가 있는 도립 광학 현미경에 장착해야 합니다. |
| Caspofungin | Sigma-Aldrich | SML0425-5MG | Caspofungin은 4 MIC(Minimum Inhibitor Concentration)의 농도로 사용되었습니다. |
| 코드 편집기 | Microsoft | Visual Studio Code version 1.40.1 | https://code.visualstudio.com/ |
| Cryobeads | IFU | CB12 | |
| Dessicator/Degassing 챔버 | Fisherbrand | 15594635 | 이 장비는 약 50분 동안 PDMS 스탬프를 탈기하는 데 사용되며, 진공 펌프와 결합된 모든 건조제가 수행합니다. |
| 페트리 식기 히터 | JPK-Bruker | PetriDishHeater | 이것은 JPK/Bruker AFM에 추가된 제품입니다. 히터는 실험 중 온도 변화를 모니터링하는 데 사용되었습니다 아 |
| 산 나트륨 완충액 pH 5.2 | Sigma-Aldrich | S7899 | 용액에는 18mM 아세트산나트륨, 1mM CaCl2 및 1mM MnCl2가 포함되어 있습니다. 빙초산으로 pH를 조정하십시오. 용액은 4°C에 저장할 수 있습니다. C 2개월 통계 |
| 분석 언어 | https://www.r-project.org | R 버전 3.6.1 | R은 통계 컴퓨팅 및 그래픽을 위한 언어 및 환경입니다. R |
| 통계 분석 소프트웨어 | https://rstudio.com | R studio 버전 1.1.463 | . RStudio 및 Shiny는 오픈 액세스 통계 재단 |
| Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | 761028 | Polydimethylsiloxane (PDMS) 및 경화제의 제휴 |
| : 효모 펩톤 D 육수 | Difco | 242820 | |
| YPD 한천 | Difco | DF0427-17-6 |
참고문헌
- Cross, S. E., Jin, Y. S., Rao, J., Gimzewski, J. K. Nanomechanical analysis of cells from cancer patients. Nature Nanotechnology. 2 (12), 780-783 (2007).
- Dague, E., et al.
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재인쇄 및 허가
