Автоматизация измерений биоатомным силовым микроскопом на сотнях клеток C. albicans
Summary
Этот протокол направлен на автоматизацию измерений AFM на сотнях микробных клеток. Сначала микробы иммобилизуются в микроструктуры штампа PDMS, а затем измерения силовой спектроскопии выполняются автоматически на сотнях иммобилизованных клеток.
Abstract
Метод, представленный в этой статье, направлен на автоматизацию экспериментов Bio-AFM и регистрацию кривых силы. Используя этот метод, можно автоматически записывать кривые сил на 1000 ячейках за 4 часа. Для поддержания 4-часового времени анализа количество кривых силы на ячейку уменьшается до 9 или 16. Метод сочетает в себе программу на основе Jython и стратегию сборки ячеек по определенным шаблонам. Программа, реализованная на коммерческом Bio-AFM, может центрировать наконечник на первой ячейке массива, а затем автоматически перемещаться от ячейки к ячейке, записывая кривые силы на каждой клетке. Используя эту методологию, можно получить доступ к биофизическим параметрам клеток, таким как их жесткость, их адгезионные свойства и т. Д. Благодаря автоматизации и большому количеству проанализированных клеток можно получить доступ к поведению клеточной популяции. Это прорыв в области Bio-AFM, где данные до сих пор были записаны только на нескольких десятках клеток.
Introduction
Эта работа предоставляет методологию для выполнения автоматических измерений силы на сотнях живых клеток с использованием атомно-силового микроскопа (AFM). Он также предоставляет метод иммобилизации микробов на микроструктурированной марке PDMS, который совместим с экспериментами AFM, проводимыми в жидкой среде.
Bio-AFM – это узкоспециализированная технология, разработанная для применения в биологии, а затем используемая для изучения живых клеток. Для этого требуется обученный инженер, который может анализировать одну клетку в то время. В этих условиях количество различных клеток, которые могут быть проанализированы, довольно мало, типично от 5 до 10 клеток за 4-5 часов. Однако количество измерений силы, регистрируемых на одной ячейке, обычно очень велико и может легко достигать 1000. Таким образом, текущая парадигма измерения силы AFM на живых клетках заключается в регистрации сотен кривых силы (ФК), но на ограниченном числе клеток.
Статистически такой подход вызывает сомнения, и поднимает вопрос о репрезентативности выборки. Действительно, трудно, например, оценить гетерогенность клеточной популяции, измеряя только несколько клеток, даже если на этих нескольких клетках регистрируются сотни измерений. Однако именно на основе этой парадигмы были достигнуты значительные успехи в биофизике, микробиологии и наномедицине1,2,3. Действительно, нанометровый анализ в масштабе одиночных клеток дал новую информацию по клеточной наномеханике, об организации трансмембранных белков или механизме действия противомикробных или противоопухолевых препаратов4,5,6,7. Однако в последнее время появилось несколько высокопроизводительных биомеханических тестов, проведенных на клетках8,показывающих заинтересованность научного сообщества в изменении этой парадигмы и доступе к гетерогенности клеточной популяции. Все эти тесты полагаются на микрофлюидные системы для деформирования клеток и оптического измерения их деформации под напряжением для получения косвенной меры их общей поверхностнойэластичности 8. Однако важной проблемой этих методов является то, что они являются монопараметрическими: можно исследовать только эластичность клеток. Более того, они не позволяют измерять механические параметры адгезивных клеток, что может быть ограничено для исследований нециркулирующих клеток млекопитающих или биопленок, например.
Подходы с участием AFM были разработаны командами S. Scheuring9 и M. Favre10. Scheuring et al. иммобилизовалы клетки на фибронектиновых паттернах9,заставляя отдельные клетки принимать форму паттерна9. Затем эта команда наметила механические свойства нескольких ячеек, чтобы определить средние данные, представляющие от 14 до 18 клеток. Разработка, выполненная Farve et al., направлена на мультиплексирование измерений путем распараллеливания кантилеверов AFM10. Насколько нам известно, эта работа в направлении мультиплексирования не привела к измерениям на живых клетках.
Интересный подход, предложенный командой Дюжардена, представляет собой автоматизированный AFM, способный идентифицировать клетки и визуализывать их на дне изготовленных на заказ скважин. Хотя этот метод не позволяет проводить анализ большой популяции клеток, он позволяет автоматически тестировать различные условия в каждой скважине11.
Наша цель в этой работе более амбициозна, так как мы хотели измерить не менее 1000 клеток для доступа не к средней клетке, а, наоборот, к гетерогенности между клетками. Стратегия, которую мы разработали здесь для доступа к гетерогенности клеточной популяции с помощью AFM, основана на анализе сотен клеток, на которых регистрируется ограниченное количество кривых силы. По сравнению с «классическим» подходом, записывающим большое количество кривых силы на ограниченном числе ячеек, этот подход следует рассматривать как комплементарный, поскольку он не дает такой же информации. Действительно, в то время как типичный метод позволяет исследовать гетерогенность отдельной клеточной поверхности, используя наш подход, мы можем получить доступ ко всей гетерогенности клеточной популяции. Для достижения этой цели мы объединили метод, который непосредственно обездвиживает микробов (здесь дрожжевой вид Candida albicans)в колодцы PDMS микроструктурированного штампа12,и разработали оригинальную программу для автоматического перемещения наконечника AFM из клетки в клетку13 и измерения механических свойств каждой клетки.
Protocol
Representative Results
Discussion
Основным улучшением, обеспечиваемым данной методологией, является значительное увеличение количества измеряемых клеток за определенный промежуток времени. Аналогом является уменьшение количества точек, измеренных на ячейку. Это означает, что этот метод не предназначен для обеспече?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотим отметить FONCYCYT CONACYT (Мексика), Министерство иностранных дел Франции и Университет Париж 13, а также финансовую поддержку международного совместного проекта ECOS-NORD под названием Nano-palpation for diagnostic, No 263337 (Мексика) и MI5P02 (Франция). ЕОМ благодарит SIP-IPN за финансовую поддержку проекта No 20195489. SPC поддерживается стипендией PhD от CONACYT (No 288029) и IPN через соглашение cotutelle для получения двойного сертификата PhD (IPN-UPS). ED и CFD являются исследователями в Национальном центре научных исследований (CNRS).
Materials
| AFM cantilever | Bruker AFM probes | MLCT | The cantilevers used were the labeled “C” with resonant frequency of 7 to 10 kHz and k: 0.01 N/m |
| AFM data analysis | JPK-Bruker | JPK Data processing version minimum 5.1.8 | Can be downloaded from a JPK-Bruker user acount |
| AFM Petri dishes | WPI | FluoroDish FD35-100 | The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment |
| Atomic force Microscope (AFM) | JPK-Bruker | Nanowizard II or III | the AFM should be mounted on an inverted optical microscope with a motorized stage |
| Caspofungin | Sigma-Aldrich | SML0425-5MG | Caspofungin was used with a concentration of 4 MIC (Minimum Inhibitor Concentration) |
| Code editor | Microsoft | Visual Studio Code version 1.40.1 | https://code.visualstudio.com/ |
| Cryobeads | IFU | CB12 | |
| Dessicator/Degassing chamber | Fisherbrand | 15594635 | The equipment is used to degassing the PDMS stamps for about 50 minutes any dessicator coupled with a vaccum pump will do. |
| Petri dish heater | JPK-Bruker | PetriDishHeater | This is an add-on to the JPK/Bruker AFM. The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment |
| Sodium acetate buffer pH 5.2 | Sigma-Aldrich | S7899 | The solution contains 18 mM sodium acetate, 1 mM CaCl2, and 1 mM MnCl2. Adjust the pH with glacial acetic acid. The solution can be stored at 4 °C for 2 months |
| Statistical analysis language | https://www.r-project.org | R version 3.6.1 | R is a language and environment for statistical computing and graphics. It is a GNU project which is similar to the S language and environment |
| Statistical analysis software | https://rstudio.com | R studio version 1.1.463 | collaboration between the R Foundation, RStudio, Microsoft, TIBCO, Google, Oracle, HP and others. RStudio and Shiny are affiliated projects of the Foundation for Open Access Statistics |
| Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | 761028 | Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent in one set |
| Yeast Peptone D Broth | Difco | 242820 | |
| YPD Agar | Difco | DF0427-17-6 |
References
- Cross, S. E., Jin, Y. S., Rao, J., Gimzewski, J. K. Nanomechanical analysis of cells from cancer patients. Nature Nanotechnology. 2 (12), 780-783 (2007).
- Dague, E., et al. Atomic force and electron microscopic-based study of sarcolemmal surface of living cardiomyocytes unveils unexpected mitochondrial shift in heart failure. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 162-172 (2014).
- Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. Force probing surfaces of living cells to molecular resolution. Nature Chemical Biology. 5 (6), 383-390 (2009).
- Dague, E. Atomic Force Microscopy to Explore Electroporation Effects on Cells. Handbook of Electroporation. , 1-13 (2016).
- Puntheeranurak, T., Neundlinger, I., Kinne, R. K. H., Hinterdorfer, P. Single-molecule recognition force spectroscopy of transmembrane transporters on living cells. Nature Protocols. 6 (9), 1443-1452 (2011).
- Formosa, C., et al. Nanoscale analysis of the effects of antibiotics and CX1 on a Pseudomonas aeruginosa multidrug-resistant strain. Scientific Reports. 2, (2012).
- Pillet, F., Chopinet, L., Formosa, C., Dague, &. #. 2. 0. 1. ;. Atomic Force Microscopy and pharmacology: From microbiology to cancerology. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – General Subjects. 1840 (3), 1028-1050 (2014).
- Wu, P. H., et al. A comparison of methods to assess cell mechanical properties. Nature Methods. 15 (7), 491-498 (2018).
- Rigato, A., Rico, F., Eghiaian, F., Piel, M., Scheuring, S. Atomic Force Microscopy Mechanical Mapping of Micropatterned Cells Shows Adhesion Geometry-Dependent Mechanical Response on Local and Global Scales. ACS Nano. 9 (6), 5846-5856 (2015).
- Favre, M., et al. Parallel AFM imaging and force spectroscopy using two-dimensional probe arrays for applications in cell biology. Journal of Molecular Recognition. 24 (3), 446-452 (2011).
- Dujardin, A., Wolf, P. D., Lafont, F., Dupres, V. Automated multi-sample acquisition and analysis using atomic force microscopy for biomedical applications. PLOS ONE. 14 (3), 0213853 (2019).
- Formosa, C., et al. Generation of living cell arrays for atomic force microscopy studies. Nature Protocols. 10 (1), 199-204 (2015).
- Proa-Coronado, S., Séverac, C., Martinez-Rivas, A., Dague, E. Beyond the paradigm of nanomechanical measurements on cells using AFM: an automated methodology to rapidly analyse thousands of cells. Nanoscale Horizons. , (2019).
- Foncy, J., et al. Comparison of polyurethane and epoxy resist master mold for nanoscale soft lithography. Microelectronic Engineering. 110, 183-187 (2013).
- Unsay, J. D., Cosentino, K., García-Sáez, A. J. Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers. Journal of Visualized Experiments. (101), e52867 (2015).
- Schiavone, M., et al. A combined chemical and enzymatic method to determine quantitatively the polysaccharide components in the cell wall of yeasts. FEMS Yeast Research. 14 (6), 933-947 (2014).
- Formosa, C., et al. Nanoscale Effects of Caspofungin against Two Yeast Species, Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (8), 3498-3506 (2013).
- El-Kirat-Chatel, S., et al. Nanoscale analysis of caspofungin-induced cell surface remodelling in Candida albicans. Nanoscale. 5 (3), 1105-1115 (2013).
- Peric, O., Hannebelle, M., Adams, J. D., Fantner, G. E. Microfluidic bacterial traps for simultaneous fluorescence and atomic force microscopy. Nano Research. 10 (11), 3896-3908 (2017).
