Automatisation des mesures de microscope à force bioatomique sur des centaines de cellules de C. albicans
Summary
Ce protocole vise à automatiser les mesures AFM sur des centaines de cellules microbiennes. Tout d’abord, les microbes sont immobilisés dans des microstructures de tampon PDMS, puis des mesures de spectroscopie de force sont effectuées automatiquement sur des centaines de cellules immobilisées.
Abstract
La méthode présentée dans cet article vise à automatiser les expériences Bio-AFM et l’enregistrement des courbes de force. En utilisant cette méthode, il est possible d’enregistrer automatiquement les courbes de forces sur 1000 cellules en 4 heures. Pour maintenir un temps d’analyse de 4 heures, le nombre de courbes de force par cellule est réduit à 9 ou 16. La méthode combine un programme basé sur Jython et une stratégie d’assemblage de cellules sur des motifs définis. Le programme, mis en œuvre sur un Bio-AFM commercial, peut centrer la pointe sur la première cellule du réseau, puis se déplacer, automatiquement, de cellule en cellule tout en enregistrant les courbes de force sur chaque cellule. Grâce à cette méthodologie, il est possible d’accéder aux paramètres biophysiques des cellules tels que leur rigidité, leurs propriétés adhésives, etc. Avec l’automatisation et le grand nombre de cellules analysées, on peut accéder au comportement de la population cellulaire. Il s’agit d’une percée dans le domaine de la bio-AFM où les données n’ont, jusqu’à présent, été enregistrées que sur quelques dizaines de cellules.
Introduction
Ce travail fournit une méthodologie pour effectuer des mesures de force automatiques sur des centaines de cellules vivantes à l’aide d’un microscope à force atomique (AFM). Il fournit également une méthode pour immobiliser les microbes sur un tampon microstructuré PDMS qui est compatible avec les expériences AFM menées dans un environnement liquide.
Bio-AFM est une technologie hautement spécialisée conçue pour des applications en biologie et ensuite utilisée pour étudier les cellules vivantes. Il nécessite un ingénieur qualifié qui peut analyser une cellule à la fois. Dans ces conditions, le nombre de cellules différentes pouvant être analysées est plutôt faible, typique de 5 à 10 cellules en 4-5 heures. Cependant, la quantité de mesures de force enregistrées sur une seule cellule est généralement très élevée et peut facilement atteindre 1000. Ainsi, le paradigme actuel des mesures de force AFM sur les cellules vivantes est d’enregistrer des centaines de courbes de force (FCs) mais sur un nombre limité de cellules.
Statistiquement, cette approche est discutable et soulève la question de la représentativité de l’échantillon. En effet, il est difficile, par exemple, d’évaluer l’hétérogénéité d’une population cellulaire en ne mesurant que quelques cellules, même si des centaines de mesures sont enregistrées sur ces quelques cellules. Cependant, c’est sur la base de ce paradigme que des avancées majeures ont été réalisées en biophysique, microbiologie et nanomédecine1,2,3. En effet, l’analyse nanométrique à l’échelle des cellules individuelles a fourni de nouvelles informations sur la nanomécanique cellulaire, sur l’organisation des protéines transmembranaires, ou sur le mécanisme d’action des médicaments antimicrobiens ou anticancéreux4,5,6,7. Récemment cependant, plusieurs tests biomécaniques à haut débit menés sur des cellules ont émergé8, montrant l’intérêt de la communauté scientifique à changer ce paradigme et à accéder à l’hétérogénéité de la population cellulaire. Ces essais s’appuient tous sur des systèmes microfluidiques pour déformer les cellules et mesurer optiquement leur déformation sous contrainte afin d’obtenir une mesure indirecte de leur élasticité globale de surface8. Cependant, un problème important avec ces méthodes est qu’elles sont mono-paramétriques: seule l’élasticité cellulaire peut être sondée. De plus, ils ne permettent pas la mesure des paramètres mécaniques des cellules adhérentes, ce qui peut être limitatif pour les études de cellules de mammifères non circulaires ou de biofilms par exemple.
Des approches impliquant l’AFM ont été développées par les équipes de S. Scheuring9 et M. Favre10. Scheuring et al. ont immobilisé des cellules sur des motifs de fibronectine9,forçant des cellules individuelles à prendre la forme du motif9. Ensuite, cette équipe a cartographié les propriétés mécaniques de quelques cellules pour définir des données moyennes, représentatives de 14 à 18 cellules. Le développement réalisé par Farve et al. visait à multiplexer les mesures en parallélisant les cantilevers AFM10. À notre connaissance, ce travail dans le sens du multiplexage n’a pas conduit à des mesures sur des cellules vivantes.
Une approche intéressante proposée par l’équipe de Dujardin présente une AFM automatisée capable d’identifier les cellules et de les imager au fond de puits sur mesure. Bien que cette méthode ne permette pas l’analyse d’une grande population de cellules, elle permet de tester automatiquement différentes conditions dans chaque puits11.
Notre objectif dans ce travail est plus ambitieux puisque nous voulions mesurer au moins 1000 cellules pour accéder non pas à une cellule moyenne, mais, au contraire, à l’hétérogénéité entre les cellules. La stratégie que nous avons développée ici pour accéder à l’hétérogénéité de la population cellulaire à l’aide de l’AFM est basée sur l’analyse de centaines de cellules sur lesquelles un nombre limité de courbes de force sont enregistrées. Par rapport à l’approche « classique » consistant à enregistrer un grand nombre de courbes de force sur un nombre limité de cellules, cette approche doit être considérée comme complémentaire car elle ne fournit pas les mêmes informations. En effet, alors que la méthode typique permet de sonder l’hétérogénéité de la surface cellulaire individuelle, en utilisant notre approche, nous sommes en mesure d’accéder à l’hétérogénéité de la population cellulaire entière. Pour atteindre cet objectif, nous avons combiné une méthode qui immobilise directement les microbes (ici l’espèce de levure Candida albicans)dans les puits d’un tampon microstructuré PDMS12,et développe un programme original pour déplacer la pointe AFM, automatiquement, de cellule en cellule13 et mesurer les propriétés mécaniques de chaque cellule.
Protocol
Representative Results
Discussion
La principale amélioration apportée par cette méthodologie est une augmentation significative du nombre de cellules mesurées dans un laps de temps déterminé. La contrepartie est une réduction du nombre de points mesurés par cellule. Cela signifie que cette méthode n’est pas conçue pour fournir une analyse détaillée d’une seule cellule. La méthode s’applique uniquement aux cellules qui peuvent tenir dans les puits du tampon PDMS. Le timbre est assez polyvalent, alors qu’il contient des puits de 1,5 x …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à saluer FONCYCYT du CONACYT (Mexique), le ministère des Affaires étrangères de la France et l’Université Paris 13, à travers le soutien financier du projet collaboratif international ECOS-NORD nommé Nano-palpation pour le diagnostic, n° 263337 (Mexique) et MI5P02 (France). AMR tient à remercier le soutien financier du SIP-IPN dans le cadre du projet no 20195489. La CPS est soutenue par une bourse de doctorat du CONACYT (n° 288029) et de l’IPN dans le cadre de l’accord de cotutelle pour l’obtention d’un double certificat de doctorat (IPN-UPS). ED et CFD sont chercheurs au Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS).
Materials
| AFM cantilever | Bruker AFM probes | MLCT | The cantilevers used were the labeled “C” with resonant frequency of 7 to 10 kHz and k: 0.01 N/m |
| AFM data analysis | JPK-Bruker | JPK Data processing version minimum 5.1.8 | Can be downloaded from a JPK-Bruker user acount |
| AFM Petri dishes | WPI | FluoroDish FD35-100 | The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment |
| Atomic force Microscope (AFM) | JPK-Bruker | Nanowizard II or III | the AFM should be mounted on an inverted optical microscope with a motorized stage |
| Caspofungin | Sigma-Aldrich | SML0425-5MG | Caspofungin was used with a concentration of 4 MIC (Minimum Inhibitor Concentration) |
| Code editor | Microsoft | Visual Studio Code version 1.40.1 | https://code.visualstudio.com/ |
| Cryobeads | IFU | CB12 | |
| Dessicator/Degassing chamber | Fisherbrand | 15594635 | The equipment is used to degassing the PDMS stamps for about 50 minutes any dessicator coupled with a vaccum pump will do. |
| Petri dish heater | JPK-Bruker | PetriDishHeater | This is an add-on to the JPK/Bruker AFM. The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment |
| Sodium acetate buffer pH 5.2 | Sigma-Aldrich | S7899 | The solution contains 18 mM sodium acetate, 1 mM CaCl2, and 1 mM MnCl2. Adjust the pH with glacial acetic acid. The solution can be stored at 4 °C for 2 months |
| Statistical analysis language | https://www.r-project.org | R version 3.6.1 | R is a language and environment for statistical computing and graphics. It is a GNU project which is similar to the S language and environment |
| Statistical analysis software | https://rstudio.com | R studio version 1.1.463 | collaboration between the R Foundation, RStudio, Microsoft, TIBCO, Google, Oracle, HP and others. RStudio and Shiny are affiliated projects of the Foundation for Open Access Statistics |
| Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | 761028 | Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent in one set |
| Yeast Peptone D Broth | Difco | 242820 | |
| YPD Agar | Difco | DF0427-17-6 |
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