수백 개의 알비칸스 세포에 대한 생체 원자력 현미경 측정 자동화
Summary
이 프로토콜은 수백 개의 미생물 세포에 대한 AFM 측정을 자동화하는 것을 목표로합니다. 첫째, 미생물은 PDMS 스탬프 미세 구조로 고정된 다음 수백 개의 고정된 세포에서 분광법 측정이 자동으로 수행됩니다.
Abstract
이 논문에 제시된 방법은 Bio-AFM 실험과 힘 곡선 의 기록을 자동화하는 것을 목표로 합니다. 이 방법을 사용하면 4시간 만에 1000셀의 힘 곡선을 자동으로 기록할 수 있습니다. 4시간 분석 시간을 유지하려면 셀당 힘 곡선 수가 9 또는 16으로 줄어듭니다. 이 방법은 Jython 기반 프로그램과 정의된 패턴에 셀을 조립하는 전략을 결합합니다. 상용 Bio-AFM에 구현된 이 프로그램은 어레이의 첫 번째 셀에 있는 팁을 중앙에 누친 다음 각 셀의 힘 곡선을 기록하는 동안 셀에서 셀로 자동으로 이동할 수 있습니다. 이 방법론을 이용하여, 그들의 강성, 그들의 접착 특성 등과 같은 세포의 생물물리학적 파라미터에 접근할 수 있다. 자동화 와 많은 수의 세포가 분석되면 세포 집단의 동작에 접근할 수 있습니다. 이것은 데이터가 있는 Bio-AFM 필드에 있는 돌파구입니다, 지금까지, 단지 수십개의 세포에 기록되었습니다.
Introduction
이 작품은 원자력 현미경 (AFM)을 사용하여 살아있는 세포의 수백에 자동 힘 측정을 수행하는 방법론을 제공합니다. 또한 액체 환경에서 수행된 AFM 실험과 호환되는 PDMS 미세 구조화 스탬프에 미생물을 고정하는 방법을 제공한다.
Bio-AFM은 생물학 응용을 위해 잉태된 다음 살아있는 세포를 연구하는 데 사용되는 고도로 전문화된 기술입니다. 그것은 시간에 하나의 셀을 분석 할 수있는 숙련 된 엔지니어가 필요합니다. 이러한 조건에서, 분석될 수 있는 상이한 세포의 수는 4-5시간 안에 오히려 작고, 전형적인 5-10세포이다. 그러나 단일 셀에 기록된 힘 측정의 양은 일반적으로 매우 높으며 쉽게 1000에 도달 할 수 있습니다. 따라서, 살아있는 세포에 대한 AFM 힘 측정의 현재 패러다임은 수백 개의 힘 곡선(FC)을 기록하지만 제한된 수의 세포에 기록된다.
통계적으로, 이 접근은 의심스럽고, 견본의 대표성의 문제를 제기합니다. 실제로, 예를 들어, 수백 개의 측정이 이 몇몇 세포에 기록되더라도, 단지 몇몇 세포를 측정하여 세포 집단의 이질성을 평가하는 것은 어렵습니다. 그러나, 생물물리학, 미생물학 및 나노의학1,2,3에서중요한 진보가 이루어진 것은 이 패러다임에기초한다. 실제로, 단일 세포의 규모에 나노미터 분석은 세포 나노역학, 막 단백질의 조직, 또는 항균 또는 항암제의 작용기전4,5,6,7에대한 새로운 정보를 제공하고있다. 그러나 최근, 세포에 실시 된 몇 가지 높은 처리량 생체 역학 테스트 등장8,이 패러다임을 변경 하 고 세포 인구 이질성에 액세스에 과학 적인 사회의 관심을 보여주는. 이러한 테스트는 모두 미세 유체 시스템에 의존하여 세포를 변형시키고 스트레스하에서 변형을 광학적으로 측정하여 전체 표면 탄성의간접측정을 8을얻습니다. 그러나 이러한 방법의 중요한 문제는 단색 파라메트릭이라는 것입니다: 세포 탄력만 조사할 수 있습니다. 더욱이, 그(것)들은 예를 들면 비순환 포유류 세포 또는 생물막의 연구를 위해 제한될 수 있는 부착된 세포의 기계적인 파라미터의 측정을 허용하지 않습니다.
AFM과 관련된 접근 방식은 S. Scheuring9 및 M. Favre10팀에 의해 개발되었습니다. 슈어링 외. 섬유네틴 패턴 에 고정 된 세포9,패턴 의 모양을 취할 개별 세포를 강제로9. 그런 다음 이 팀은 14~18개의 셀을 대표하는 평균 데이터를 정의하기 위해 몇 셀의 기계적 특성을 매핑했습니다. AFM캔틸레버(10)를병렬화하여 측정을 멀티플렉싱하는 것을 목표로 Farve 등에서 수행한 개발. 우리의 지식에, 멀티 플렉스 방향으로이 작업은 살아있는 세포에 측정으로 이어지지 않았습니다.
Dujardin의 팀이 제안한 흥미로운 접근 방식은 세포를 식별하고 맞춤형 우물의 바닥에서 이미징할 수 있는 자동화된 AFM을 제공합니다. 이 방법은 세포의 큰 집단의 분석을 허용하지 않지만, 각 웰11에서다른 조건의 자동 테스트를 허용한다.
이 일에 있는 우리의 목표는 우리가 평균 세포가 아니라, 반대로, 세포 사이 이질성에 접근하기 위하여 적어도 1000세포를 측정하고 싶었기 때문에 더 야심차다. AFM을 사용하여 세포 인구 이질성에 접근하기 위해 여기에서 개발한 전략은 제한된 수의 힘 곡선이 기록되는 수백 개의 세포의 분석을 기반으로 합니다. 제한된 수의 셀에 많은 수의 힘 곡선을 기록하는 “고전적인” 접근법과 비교하여, 이 접근법은 동일한 정보를 제공하지 않기 때문에 상호 보완적인 것으로 간주되어야 합니다. 실제로, 일반적인 방법은 개별적인 세포 표면 이질성을 탐구하는 것을 허용하는 동안, 우리의 접근을 사용하여, 우리는 전체 세포 집단 이질성에 접근할 수 있습니다. 이러한 목적을 달성하기 위해, 우리는 직접 PDMS 미세 구조스탬프(12)의우물에 미생물 (여기에 효모 종 칸디다 알비칸)을고정하는 방법을 결합하고, 자동으로, 세포에서 세포(13)에 세포에서, 각 세포의 기계적 특성을 측정AFM 팁을 이동하기위한 원래 프로그램을 개발하고 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 방법론에서 제공하는 주요 개선사항은 측정된 시간 단위로 측정된 세포의 수가 현저한 증가입니다. 대응은 셀당 측정된 점수의 감소입니다. 즉, 이 방법은 단일 셀에 대한 자세한 분석을 제공하도록 설계되지 않았습니다. 이 방법은 PDMS 스탬프의 우물에 들어갈 수 있는 셀에만 적용됩니다. 스탬프는 매우 다재다능하며, 1.5 x 1.5 μm2최대 6 x 6 μm 2의 우물을 포함하고있습니다. 여?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 CONACYT (멕시코), 프랑스 외무부및 유니버시테 파리 13의 FONCYCYT를 인정하고 싶습니다, 국제 협력 ECOS-NORD 프로젝트의 재정 지원하지만 진단나노-palpation, No. 263337 (멕시코) 및 MI5P02 (프랑스). AMR은 프로젝트 No. 20195489 통해 SIP-IPN의 재정 지원에 감사드립니다. SPC는 COtutelle 계약을 통해 CONACYT(no. 288029)와 IPN의 박사 학위 펠로우십에 의해 지원되며, 이중 박사 학위(IPN-UPS)를 획득합니다. ED와 CFD는 센터 내셔널 드 라 레체르체 시엔티피크 (CNRS)의 연구원입니다.
Materials
| AFM cantilever | Bruker AFM probes | MLCT | The cantilevers used were the labeled “C” with resonant frequency of 7 to 10 kHz and k: 0.01 N/m |
| AFM data analysis | JPK-Bruker | JPK Data processing version minimum 5.1.8 | Can be downloaded from a JPK-Bruker user acount |
| AFM Petri dishes | WPI | FluoroDish FD35-100 | The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment |
| Atomic force Microscope (AFM) | JPK-Bruker | Nanowizard II or III | the AFM should be mounted on an inverted optical microscope with a motorized stage |
| Caspofungin | Sigma-Aldrich | SML0425-5MG | Caspofungin was used with a concentration of 4 MIC (Minimum Inhibitor Concentration) |
| Code editor | Microsoft | Visual Studio Code version 1.40.1 | https://code.visualstudio.com/ |
| Cryobeads | IFU | CB12 | |
| Dessicator/Degassing chamber | Fisherbrand | 15594635 | The equipment is used to degassing the PDMS stamps for about 50 minutes any dessicator coupled with a vaccum pump will do. |
| Petri dish heater | JPK-Bruker | PetriDishHeater | This is an add-on to the JPK/Bruker AFM. The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment |
| Sodium acetate buffer pH 5.2 | Sigma-Aldrich | S7899 | The solution contains 18 mM sodium acetate, 1 mM CaCl2, and 1 mM MnCl2. Adjust the pH with glacial acetic acid. The solution can be stored at 4 °C for 2 months |
| Statistical analysis language | https://www.r-project.org | R version 3.6.1 | R is a language and environment for statistical computing and graphics. It is a GNU project which is similar to the S language and environment |
| Statistical analysis software | https://rstudio.com | R studio version 1.1.463 | collaboration between the R Foundation, RStudio, Microsoft, TIBCO, Google, Oracle, HP and others. RStudio and Shiny are affiliated projects of the Foundation for Open Access Statistics |
| Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | 761028 | Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent in one set |
| Yeast Peptone D Broth | Difco | 242820 | |
| YPD Agar | Difco | DF0427-17-6 |
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