Automação de Medições de Microscópio de Força Bio-Atômica em centenas de células de C. albicans
Summary
Este protocolo visa automatizar as medições de AFM em centenas de células microbianas. Primeiro, micróbios são imobilizados em microestruturas de selo PDMS e, em seguida, as medições de espectroscopia de força são realizadas automaticamente em centenas de células imobilizadas.
Abstract
O método apresentado neste artigo visa automatizar experimentos Bio-AFM e o registro de curvas de força. Usando este método, é possível registrar curvas de forças em 1000 células em 4 horas automaticamente. Para manter um tempo de análise de 4 horas, o número de curvas de força por célula é reduzido para 9 ou 16. O método combina um programa baseado em Jython e uma estratégia para a montagem de células em padrões definidos. O programa, implementado em um Bio-AFM comercial, pode centralizar a ponta na primeira célula da matriz e, em seguida, mover-se, automaticamente, de célula para célula enquanto grava curvas de força em cada célula. Utilizando essa metodologia, é possível acessar os parâmetros biofísicos das células, como sua rigidez, suas propriedades adesivas, etc. Com a automação e o grande número de células analisadas, pode-se acessar o comportamento da população celular. Este é um avanço no campo Bio-AFM onde os dados foram, até agora, registrados em apenas algumas dezenas de células.
Introduction
Este trabalho fornece uma metodologia para realizar medições automáticas de força em centenas de células vivas usando um microscópio de força atômica (AFM). Também fornece um método para imobilizar micróbios em um selo microestruturado PDMS compatível com experimentos AFM realizados em um ambiente líquido.
Bio-AFM é uma tecnologia altamente especializada concebida para aplicações em biologia e, em seguida, usada para estudar células vivas. Requer um engenheiro treinado que possa analisar uma célula no momento. Nessas condições, o número de células diferentes que podem ser analisadas é bastante pequeno, típico de 5 a 10 células em 4-5 horas. No entanto, a quantidade de medidas de força registradas em uma única célula são geralmente muito altas e podem facilmente chegar a 1000. Assim, o paradigma atual das medições de força afm em células vivas é registrar centenas de curvas de força (FCs), mas em um número limitado de células.
Estatisticamente, essa abordagem é questionável e levanta a questão da representatividade da amostra. De fato, é difícil, por exemplo, avaliar a heterogeneidade de uma população celular medindo apenas algumas células, mesmo que centenas de medidas sejam registradas nessas poucas células. No entanto, é com base nesse paradigma que grandes avanços têm sido feitos na biofísica, microbiologia e nanomedicina1,2,3. De fato, a análise de nanômetros na escala de células únicas forneceu novas informações sobre a nanomecânica celular, sobre a organização de proteínas transmembranas, ou o mecanismo de ação de drogas antimicrobianas ou anticancerígenas4,5,6,7. Recentemente, no entanto, vários testes biomecânicos de alto rendimento realizados em células surgiram8, mostrando o interesse da comunidade científica em mudar esse paradigma e acessar a heterogeneidade da população celular. Todos esses testes dependem de sistemas microfluidos para deformar as células e medir opticamente sua deformação sob estresse para obter uma medida indireta de sua elasticidade superficial global8. No entanto, uma questão importante com esses métodos é que eles são mono-paramétricos: apenas a elasticidade celular pode ser sondada. Além disso, não permitem a medição dos parâmetros mecânicos das células aderentes, o que pode ser limitador para os estudos de células mamíferas não circulantes ou biofilmes, por exemplo.
Abordagens envolvendo AFM foram desenvolvidas pelas equipes de S. Scheuring9 e M. Favre10. Scheuring et al. células imobilizadas nos padrões de fibronectina9, forçando as células individuais a tomar a forma do padrão9. Em seguida, esta equipe mapeou as propriedades mecânicas de algumas células para definir dados médios, representativos de 14 a 18 células. O desenvolvimento realizado pela Farve et al. teve como objetivo multiplexar as medidas, paralelaizando as cantilevers AFM10. Pelo que sabemos, esse trabalho na direção multiplexa-se não levou a medições em células vivas.
Uma abordagem interessante proposta pela equipe de Dujardin apresenta um AFM automatizado capaz de identificar células e imagens na parte inferior de poços feitos sob medida. Embora este método não permita a análise de uma grande população de células, permite o teste automático de diferentes condições em cada poço11.
Nosso objetivo neste trabalho é mais ambicioso, pois queríamos medir pelo menos 1000 células para acessar não uma célula média, mas, pelo contrário, a heterogeneidade entre as células. A estratégia que desenvolvemos aqui para acessar a heterogeneidade da população celular usando a AFM baseia-se na análise de centenas de células nas quais um número limitado de curvas de força são registradas. Em comparação com a abordagem “clássica” de registrar um grande número de curvas de força em um número limitado de células, essa abordagem deve ser considerada complementar, uma vez que não fornece as mesmas informações. De fato, enquanto o método típico permite sondar a heterogeneidade da superfície celular individual, usando nossa abordagem, somos capazes de acessar toda a heterogeneidade da população celular. Para alcançar esse objetivo, combinamos um método que imobiliza diretamente micróbios (aqui a espécie de levedura Candida albicans) nos poços de um selo microestruturado PDMS12, e desenvolve um programa original para mover a ponta AFM, automaticamente, de célula para célula13 e medir as propriedades mecânicas de cada célula.
Protocol
Representative Results
Discussion
A principal melhoria proporcionada por essa metodologia é um aumento significativo no número de células medidas em um determinado período de tempo. A contrapartida é a redução do número de pontos medidos por célula. Significa que este método não foi projetado para fornecer uma análise detalhada de uma única célula. O método só se aplica a células que podem caber nos poços do selo PDMS. O selo é bastante versátil, enquanto contém poços de 1,5 x 1,5 μm2 até 6 x 6 μm2. Ainda as…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Queremos reconhecer o FONCYCYT da CONACYT (México), o Ministério das Relações Exteriores da França e a Université Paris 13, embora o apoio financeiro do projeto internacional colaborativo ECOS-NORD chamado Nano-palpaation for diagnosis, No. 263337 (México) e MI5P02 (França). A AMR agradece o apoio financeiro da SIP-IPN através do projeto nº 20195489. O SPC é apoiado por uma bolsa de doutorado da CONACYT (No. 288029) e da IPN através do acordo cotutelle para obter certificado de doutorado duplo (IPN-UPS). Ed e CFD são pesquisadores do Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS).
Materials
| AFM cantilever | Bruker AFM probes | MLCT | The cantilevers used were the labeled “C” with resonant frequency of 7 to 10 kHz and k: 0.01 N/m |
| AFM data analysis | JPK-Bruker | JPK Data processing version minimum 5.1.8 | Can be downloaded from a JPK-Bruker user acount |
| AFM Petri dishes | WPI | FluoroDish FD35-100 | The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment |
| Atomic force Microscope (AFM) | JPK-Bruker | Nanowizard II or III | the AFM should be mounted on an inverted optical microscope with a motorized stage |
| Caspofungin | Sigma-Aldrich | SML0425-5MG | Caspofungin was used with a concentration of 4 MIC (Minimum Inhibitor Concentration) |
| Code editor | Microsoft | Visual Studio Code version 1.40.1 | https://code.visualstudio.com/ |
| Cryobeads | IFU | CB12 | |
| Dessicator/Degassing chamber | Fisherbrand | 15594635 | The equipment is used to degassing the PDMS stamps for about 50 minutes any dessicator coupled with a vaccum pump will do. |
| Petri dish heater | JPK-Bruker | PetriDishHeater | This is an add-on to the JPK/Bruker AFM. The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment |
| Sodium acetate buffer pH 5.2 | Sigma-Aldrich | S7899 | The solution contains 18 mM sodium acetate, 1 mM CaCl2, and 1 mM MnCl2. Adjust the pH with glacial acetic acid. The solution can be stored at 4 °C for 2 months |
| Statistical analysis language | https://www.r-project.org | R version 3.6.1 | R is a language and environment for statistical computing and graphics. It is a GNU project which is similar to the S language and environment |
| Statistical analysis software | https://rstudio.com | R studio version 1.1.463 | collaboration between the R Foundation, RStudio, Microsoft, TIBCO, Google, Oracle, HP and others. RStudio and Shiny are affiliated projects of the Foundation for Open Access Statistics |
| Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | 761028 | Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent in one set |
| Yeast Peptone D Broth | Difco | 242820 | |
| YPD Agar | Difco | DF0427-17-6 |
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