Summary

Zuivering van tubuline met gecontroleerde posttranslationele modificaties en isotypes uit beperkte bronnen door polymerisatie-depolymerisatiecycli

Published: November 05, 2020
doi:

Summary

Dit protocol beschrijft tubulinezuivering uit kleine/middelgrote bronnen zoals gekweekte cellen of enkele muizenhersenen, met behulp van polymerisatie- en depolymerisatiecycli. De gezuiverde tubuline is verrijkt in specifieke isotypes of heeft specifieke posttranslationele modificaties en kan worden gebruikt in in vitro reconstitutietesten om microtubulidynamiek en interacties te bestuderen.

Abstract

Een belangrijk aspect van studies van het microtubulicytoskelet is het onderzoek naar microtubuligedrag in in vitro reconstitutie-experimenten. Ze maken de analyse mogelijk van de intrinsieke eigenschappen van microtubuli, zoals dynamiek, en hun interacties met microtubuli-geassocieerde eiwitten (MAPs). De “tubulinecode” is een opkomend concept dat wijst op verschillende tubuline-isotypes en verschillende posttranslationele modificaties (PTM’s) als regulatoren van microtubuli-eigenschappen en -functies. Om de moleculaire mechanismen van de tubulinecode te onderzoeken, is het cruciaal om in vitro reconstitutie-experimenten uit te voeren met gezuiverde tubuline met specifieke isotypes en PTM’s.

Tot op heden was dit technisch uitdagend omdat hersentubulin, dat veel wordt gebruikt in in vitro experimenten, veel PTM’s herbergt en een gedefinieerde isotypesamenstelling heeft. Daarom ontwikkelden we dit protocol om tubuline te zuiveren uit verschillende bronnen en met verschillende isotypesamenstellingen en gecontroleerde PTM’s, met behulp van de klassieke benadering van polymerisatie- en depolymerisatiecycli. In vergelijking met bestaande methoden op basis van affiniteitszuivering levert deze aanpak zuivere, polymerisatie-competente tubuline op, omdat tubuline die bestand is tegen polymerisatie of depolymerisatie tijdens de opeenvolgende zuiveringsstappen wordt weggegooid.

We beschrijven de zuivering van tubuline uit cellijnen, gekweekt in suspensie of als aanhangculturen, en uit enkele muizenhersenen. De methode beschrijft eerst de generatie van celmassa in zowel suspensie- als aanhanginstellingen, de lysisstap, gevolgd door de opeenvolgende stadia van tubulinezuivering door polymerisatie-depolymerisatiecycli. Onze methode levert tubuline op dat kan worden gebruikt in experimenten die de impact van de tubulinecode op de intrinsieke eigenschappen van microtubuli en microtubuliinteracties met bijbehorende eiwitten aanpakken.

Introduction

Microtubuli spelen een cruciale rol in veel cellulaire processen. Ze geven cellen hun vorm, bouwen meiotische en mitotische spindels voor chromosoomsegregatie en dienen als sporen voor intracellulair transport. Om deze diverse functies uit te voeren, organiseren microtubuli zich op verschillende manieren. Een van de intrigerende vragen in het veld is om de moleculaire mechanismen te begrijpen die de structureel en evolutionair geconserveerde microtubuli in staat stellen zich aan te passen aan deze overvloed aan organisaties en functies. Een potentieel mechanisme is de diversificatie van microtubuli , die wordt gedefinieerd door het concept dat bekend staat als de “tubulinecode”1,2,3. De tubulinecode omvat twee hoofdcomponenten: differentiële integratie van α- en β tubuline-genproducten (tubuline-isotypes) in de microtubuli en tubuline-posttranslationele modificaties (PTM’s).

Sinds de jaren 1970 hebben in vitro reconstitutie-experimenten, gecombineerd met evoluerende lichtmicroscopietechnieken, de weg vrijgemaakt voor belangrijke ontdekkingen over de eigenschappen van microtubuli: dynamische instabiliteit4 en loopbanden5, en hun andere mechanismen en functies6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. Bijna alle tot nu toe uitgevoerde in vitro experimenten zijn gebaseerd op tubuline gezuiverd uit hersenweefsel met behulp van herhaalde cycli van polymerisatie en depolymerisatie16,17. Hoewel zuivering uit het hersenweefsel het voordeel oplevert van het verkrijgen van hoogwaardige tubuline in grote hoeveelheden (meestal gramhoeveelheden), is een belangrijk nadeel de heterogeniteit, omdat tubuline gezuiverd uit hersenweefsel een mengsel is van verschillende tubuline-isotypes en is verrijkt met veel tubuline-PTMs. Deze heterogeniteit maakt het onmogelijk om de rol van een bepaald tubuline PTM of isotype af te baken in de controle van microtubuli eigenschappen en functies. Het produceren van assemblage-competente tubuline met gecontroleerde tubuline PTMs en homogene isotype samenstelling is dus essentieel om de moleculaire mechanismen van de tubulinecode aan te pakken.

Onlangs is een benadering ontwikkeld om tubuline te zuiveren door affiniteitschromatografie met behulp van het microtubulibindende TOG-domein (tumor-overexpressed gen) van gist Stu2p18. Bij deze methode wordt tubuline in ruwe lysaten van cellen of weefsel door een kolom geleid waar het zich bindt aan het matrix-geïmmobiliseerde TOG-domein, waardoor de hele tubulinepool van een bepaald, zelfs zeer klein monster kan worden geanalyseerd. De afgelopen jaren is ook een langverwachte aanpak beschreven om recombinante tubuline te zuiveren. Het is gebaseerd op het baculovirussysteem, waarbij een bi-cistronic vector met α- en β tubulinegenen wordt uitgedrukt in insectencellen19. Deze methode is echter zeer omslachtig en tijdrovend en wordt daarom meestal gebruikt voor het bestuderen van de impact van tubulinemutaties20 en tubuline-isotypes21,22,23 in vitro.

In het huidige protocol beschrijven we een methode die de gevestigde en veel gebruikte polymerisatie-depolymerisatiebenadering gebruikt als blauwdruk om tubuline te genereren met verschillende niveaus van modificatie, hetzij van cellijnen of van muishersenweefsel24. Bij deze procedure wordt tubuline gefietst tussen de oplosbare (tubuline dimer bij 4 °C) en gepolymeriseerde vorm (microtubuli bij 30 °C in aanwezigheid van guanosine 5′-trifosfaat [GTP]). Elke vorm wordt gescheiden door opeenvolgende stappen van centrifugeren: tubuline dimers blijven in het supernatant na een koude (4 °C) spin, terwijl microtubuli worden geplet bij 30 °C. Bovendien wordt één polymerisatiestap uitgevoerd bij een hogepiperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonzuur) (PIPES) concentratie, die het mogelijk maakt om microtubuli-geassocieerde eiwitten uit de microtubuli en dus uit de uiteindelijk gezuiverde tubuline te verwijderen. Tubuline gezuiverd uit HeLa S3-cellen gekweekt als suspensie – of aanhangculturen is vrijwel vrij van tubuline PTM en is gebruikt in recente in vitro reconstitutie-experimenten25,26,27,28. We hebben de methode om tubuline te zuiveren van enkele muizenhersenen verder aangepast, die kan worden gebruikt voor een groot aantal muismodellen met veranderingen in tubuline-isotypes en PTM’s.

In het protocol beschrijven we eerst de generatie van het bronmateriaal (celmassa of hersenweefsel), de lysis ervan(figuur 1A),gevolgd door de opeenvolgende stappen van tubulinepolymerisatie en depolymerisatie om de tubuline te zuiveren (Figuur 1B). We beschrijven verder het proces om de zuiverheid (figuur 2A, B) en de hoeveelheid ( figuur3A, B) van de gezuiverde tubuline te beoordelen. De methode kan worden aangepast om tubuline te produceren verrijkt met een geselecteerde PTM door een modificerend enzym in cellen te overexpresseren voorafgaand aan tubulinezuivering (figuur 4B). Als alternatief kunnen tubuline-modificerende enzymen tijdens het zuiveringsproces aan tubuline worden toegevoegd. Ten slotte kunnen we tubuline zonder specifieke isotypes of PTM’s zuiveren uit de hersenen van muizen met een tekort aan de overeenkomstige tubuline-modificerende enzymen (figuur 4B)29.

De methode die we hier beschrijven heeft twee belangrijke voordelen: (i) het maakt de productie van voldoende grote hoeveelheden tubuline in relatief korte tijd mogelijk, en (ii) het genereert hoogwaardige, zuivere tubuline, met ofwel specifieke tubuline isotype samenstelling of PTMs. In de bijbehorende video van dit manuscript belichten we enkele van de kritieke stappen die bij deze procedure betrokken zijn.

Protocol

De verzorging en het gebruik van dieren voor dit onderzoek zijn uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen van de Europese Gemeenschap (2010/63/UE). Experimentele procedures werden specifiek goedgekeurd door de ethische commissie van het Institut Curie CEEA-IC #118 (autorisatienr. 04395.03 gegeven door de Nationale Autoriteit) in overeenstemming met de internationale richtlijnen. 1. Bereiding van reagentia voor tubulinezuivering OPMERKING: Alle buffers die wor…

Representative Results

Het belangrijkste doel van deze methode is om hoogwaardige, assemblage-competente tubuline te produceren in hoeveelheden die voldoende zijn om herhaalde in vitro experimenten met de gezuiverde componenten uit te voeren. Microtubuli die uit deze tubuline worden geassembleerd, kunnen worden gebruikt bij reconstitutietests op basis van de totale interne reflectiefluorescentie (TIRF) microscopietechniek met dynamische of stabiele microtubuli, in experimenten waarbij microtubulidynamiek, interacties met MAPs of moleculaire mo…

Discussion

De hier beschreven methode biedt een platform om snel hoogwaardige, assemblage-competente tubuline in middelgrote hoeveelheden te genereren uit cellijnen en enkele muizenhersenen. Het is gebaseerd op het gouden-standaardprotocol van tubulinezuivering van runderhersenen die vele jaren in het veld worden gebruikt16,17. Een bijzonder voordeel van de aanpak is het gebruik van suspensieculturen van HeLa S3-cellen, die, eenmaal vastgesteld, grote hoeveelheden cellen op…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door de ANR-10-IDEX-0001-02, de LabEx Cell’n’Scale ANR-11-LBX-0038 en het Institut de convergence Q-life ANR-17-CONV-0005. CJ wordt ondersteund door het Institut Curie, het Franse National Research Agency (ANR) kent ANR-12-BSV2-0007 en ANR-17-CE13-0021 toe, het Institut National du Cancer (INCA) subsidie 2014-PL BIO-11-ICR-1, en de Fondation pour la Recherche Medicale (FRM) subsidie DEQ20170336. MMM wordt ondersteund door de Fondation Vaincre Alzheimer grant FR-16055p, en door de France Alzheimer grant AAP SM 2019 n°2023. JAS werd ondersteund door het horizon 2020-onderzoek- en innovatieprogramma van de Europese Unie in het kader van de Marie Skłodowska-Curie-subsidieovereenkomst nr. SB werd ondersteund door de FRM-subsidie FDT201805005465.

We danken alle leden van het Janke lab, in het bijzonder J. Souphron, evenals G. Lakisic (Institut MICALIS, AgroParisTech) en A. Gautreau (Ecole Polytechnique) voor hulp bij het opstellen van het protocol. We willen de dierenfaciliteit van het Institut Curie bedanken voor hulp bij het fokken en verzorgen van muizen.

Het antilichaam 12G10, ontwikkeld door J. Frankel en M. Nelson, werd verkregen uit de Developmental Studies Hybridoma Bank ontwikkeld onder auspiciën van de NICHD en onderhouden door de Universiteit van Iowa.

Materials

1 M MgCl2  Sigma #M1028
1-L cell culture vessels Techne F7610  Used for spinner cultures. Never stir the empty spinner bottles. When spinner bottles are in the cell culture incubator, always keep the lateral valves of spinner bottles slightly open to facilitate the equilibration of media with incubator’s atmosphere. After use, fill the spinner bottles immediately with tap water to avoid drying of remaining cells on the bottle walls. Wash the bottles with deionised water, add app 200 ml of deionised water and autoclave. Under a sterile cell culture hood remove the water and allow the bottles to dry completely, still under the hood, for several hours. Never use detergents for cleaning the spinner bottles because any trace amounts of the detergent can be deleterious to the cells.
1.5- and 2-ml tubes
14-ml round-bottom tubes
15-cm-diameter sterile culture dishes
15-ml screw-cap tubes
2-mercaptoethanol  Sigma  #M3148 2-mercaptoethanol is toxic and should be used under the hood.
4-(2-aminoethyl)-benzenesulfonyl fluoride  Sigma  #A8456
40% Acrylamide  Bio-Rad  #161-0140
5-, 10- 20-ml syringes
5-ml, 10-ml, 25-ml sterile pipettes
50-ml screw-cap tubes
Ammonium persulfate (APS) Sigma #A3678
Anti-alpha-tubulin antibody, 12G10  Developed by J. Frankel and M. Nelson, obtained from the Developmental Studies Hybridoma Bank, developed under the auspices of the NICHD, and maintained by the University of Iowa dilution: 1/500
Anti-glutamylated tubulin antibody, GT335  AdipoGen  #AG-20B-0020 dilution: 1/20,000
Aprotinin  Sigma  #A1153
Balance (0.1 – 10 g)
Beckman 1-l polypropylene bottles  For collecting spinner cultures
Beckman Avanti J-26 XP centrifuge For collecting spinner cultures
Biological stirrer  Techne MCS-104L  Installed in the cell culture incubator (for spinner cultures), 25 rpm for Hela S3 and HEK 293 cells
Bis N,N’-Methylene-Bis-Acrylamide  Bio-Rad  #161-0201
Blender IKA Ultra-Turrax®  For lysing brain tissue, use 5-mm probe, with the machine set at power 6 or 7. Blend the brain tissue 2-3 times for 15 s on ice.
Bovine serum albumin (BSA) Sigma  #A7906
Bromophenol blue  Sigma  #1.08122
Carboxypeptidase A (CPA) Sigma #C9268 Concentration: 1.7 U/µl
Cell culture hood
Cell culture incubator set at 37°C, 5% CO2
Dimethyl sulfoxide (DMSO)  Sigma  #D8418 DMSO can enhance cell and skin permeability of other compounds. Avoid contact and use skin and eye protection.
DMEM medium  Life Technologies  #41965062
DTT, DL-Dithiothreitol  Sigma  #D9779
EDTA Euromedex #EU0007-C
EGTA Sigma  #E3889
Ethanol absolute  Fisher Chemical  #E/0650DF/15
Fetal bovine serum (FBS) Sigma  #F7524
French pressure cell press  Thermo electron corporation  #FA-078A with a #FA-032 cell; for lysing big amounts of cells. Set at medium ratio, and the gauge pressure of 1,000 psi (corresponds to 3,000 psi inside the disruption chamber).
Glycerol  VWR Chemicals  #24388.295
Glycine Sigma #G8898
GTP  Sigma  #G8877
Heating block  Stuart  #SBH130D
Hela cells  ATCC® CCL-2™
Hela S3 cells  ATCC ATCC® CCL-2.2™
Hydrochloric acid (HCl ) VWR #20252.290
Inverted microscope  With fluorescence if cell transfection is to be verified
Isopropanol  VWR  #20842.298
jetPEI Polyplus  #101
JLA-8.1000 rotor  For collecting spinner cultures
KOH  Sigma  #P1767 KOH is corrosive and causes burns; use eye and skin protection.
L-Glutamine  Life Technologies  #25030123
Laboratory centrifuge for 50-ml tubes Sigma 4-16 K 
Leupeptin  Sigma #L2884
Liquid nitrogen 
Micro-pipettes p2.5, p10, p20, p100, p200 and p1000 and corresponding tips
Micropestles Eppendorf #0030 120.973
Mouse brain tissue  Animal care and use for this study were performed in accordance with the recommendations of the European Community (2010/63/UE). Experimental procedures were specifically approved by the ethics committee of the Institut Curie CEEA-IC #118 (authorization no. 04395.03 given by National Authority) in compliance with the international guidelines.
Needles 18G X 1 ½” (1.2 X 38 mm Terumo #18G
Needles 20G X 1 ½” (0.9 X 38 mm Terumo #20G
Needles 21G X 4 ¾” (0.8 X 120 mm B.Braun #466 5643
Parafilm
PBS  Life Technologies  #14190169
Penicillin-Streptomycin  Life Technologies  #15140130
pH-meter
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Sigma  #P7626 PMSF powder is hazardous. Use skin and eye protection when preparing PMSF solutions.
PIPES  Sigma  #P6757
Pipette-boy
Rotors Beckman 70.1 Ti; TLA-100.3; and TLA 55
SDS-PAGE electrophoresis equipment  Bio-Rad  #1658001FC
SDS, Sodium dodecyl sulphate  VWR  #442444H For preparing Laemmeli buffer 
SDS, Sodium dodecyl sulphate  Sigma  #L5750 For preparing 'TUB' SDS-PAGE gels
Sonicator  Branson #101-148-070 Used for lysing cells grown as adherent cultures. Use 6.5 mm diameter probe, set the sonicator at “Output control” 1, “Duty cycle” 10% and time depending on the cell type used.
Tabletop centrifuge for 1.5 ml tubes Eppendorf 5417R 
TEMED, N, N, N′, N′-Tetramethylethylenediamine  Sigma #9281
Trichostatin A (TSA) Sigma #T8552
Triton X-100  Sigma  #T9284
Trizma base (Tris) Sigma  #T1503
Trypsin  Life Technologies #15090046
Ultracentrifuge rotors  TLA-55, TLA-100.3 and 70.1 Ti rotors Set at 4°C or 30°C based on the need of the experiment 
Ultracentrifuge tubes  Beckman #357448  for using with TLA-55 rotor
Ultracentrifuge tubes  Beckman #349622 for using with TLA-100.3 rotor
Ultracentrifuge tubes  Beckman #355631  for using with 70.1 Ti rotor
Ultracentrifuges Beckman Optima L80-XP (or equivalent) and Optima MAX-XP (or equivalent) Set at 4°C or 30°C based on the need of the experiment 
Vortex mixer
Water bath equipped with floaters or tube holders Set at 30°C 

References

  1. Verhey, K. J., Gaertig, J. The tubulin code. Cell Cycle. 6 (17), 2152-2160 (2007).
  2. Janke, C. The tubulin code: Molecular components, readout mechanisms, and functions. Journal of Cell Biology. 206 (4), 461-472 (2014).
  3. Janke, C., Magiera, M. M. The tubulin code and its role in controlling microtubule properties and functions. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 21 (6), 307-326 (2020).
  4. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
  5. Margolis, R. L., Wilson, L. Opposite end assembly and disassembly of microtubules at steady state in vitro. Cell. 13 (1), 1-8 (1978).
  6. Borisy, G. G., Olmsted, J. B. Nucleated assembly of microtubules in porcine brain extracts. Science. 177 (55), 1196-1197 (1972).
  7. Kirschner, M. W., Williams, R. C. The mechanism of microtubule assembly in vitro. Journal of Supramolecular Structure. 2 (2-4), 412-428 (1974).
  8. Baas, P. W., Lin, S. Hooks and comets: The story of microtubule polarity orientation in the neuron. Developmental Neurobiology. 71 (6), 403-418 (2011).
  9. Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
  10. Nedelec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. Self-organization of microtubules and motors. Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).
  11. Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps. Cell. 142 (3), 420-432 (2010).
  12. Roostalu, J., et al. Directional switching of the kinesin Cin8 through motor coupling. Science. 332 (6025), 94-99 (2011).
  13. Schaedel, L., et al. Microtubules self-repair in response to mechanical stress. Nature Materials. 14 (11), 1156-1163 (2015).
  14. Hendricks, A. G., Goldman, Y. E., Holzbaur, E. L. F. Reconstituting the motility of isolated intracellular cargoes. Methods in Enzymology. 540, 249-262 (2014).
  15. Dogterom, M., Surrey, T. Microtubule organization in vitro. Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 23-29 (2013).
  16. Vallee, R. B. Reversible assembly purification of microtubules without assembly-promoting agents and further purification of tubulin, microtubule-associated proteins, and MAP fragments. Methods in Enzymology. 134, 89-104 (1986).
  17. Castoldi, M., Popov, A. V. Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer. Protein Expression and Purification. 32 (1), 83-88 (2003).
  18. Widlund, P. O., et al. One-step purification of assembly-competent tubulin from diverse eukaryotic sources. Molecular Biology of the Cell. 23 (22), 4393-4401 (2012).
  19. Minoura, I., et al. Overexpression, purification, and functional analysis of recombinant human tubulin dimer. FEBS Letters. 587 (21), 3450-3455 (2013).
  20. Uchimura, S., et al. A flipped ion pair at the dynein-microtubule interface is critical for dynein motility and ATPase activation. Journal of Cell Biology. 208 (2), 211-222 (2015).
  21. Pamula, M. C., Ti, S. C., Kapoor, T. M. The structured core of human beta tubulin confers isotype-specific polymerization properties. Journal of Cell Biology. 213 (4), 425-433 (2016).
  22. Vemu, A., et al. Structure and dynamics of single-isoform recombinant neuronal Human tubulin. Journal of Biological Chemistry. 291 (25), 12907-12915 (2016).
  23. Ti, S. C., Alushin, G. M., Kapoor, T. M. Human beta-tubulin isotypes can regulate microtubule protofilament number and stability. Developmental Cell. 47 (2), 175-190 (2018).
  24. Souphron, J., et al. Purification of tubulin with controlled post-translational modifications by polymerization-depolymerization cycles. Nature Protocols. 14, 1634-1660 (2019).
  25. Barisic, M., et al. Microtubule detyrosination guides chromosomes during mitosis. Science. 348 (6236), 799-803 (2015).
  26. Nirschl, J. J., Magiera, M. M., Lazarus, J. E., Janke, C., Holzbaur, E. L. F. alpha-Tubulin tyrosination and CLIP-170 phosphorylation regulate the initiation of dynein-driven transport in neurons. Cell Reports. 14 (11), 2637-2652 (2016).
  27. Guedes-Dias, P., et al. Kinesin-3 responds to local microtubule dynamics to target synaptic cargo delivery to the presynapse. Current Biology. 29 (2), 268-282 (2019).
  28. Luo, Y., et al. Direct observation of dynamic protein interactions involving human microtubules using solid-state NMR spectroscopy. Nature Communications. 11 (1), 18 (2020).
  29. Even, A., et al. ATAT1-enriched vesicles promote microtubule acetylation via axonal transport. Science Advances. 5 (12), 2705 (2019).
  30. Wolff, J., Sackett, D. L., Knipling, L. Cation selective promotion of tubulin polymerization by alkali metal chlorides. Protein Science. 5 (10), 2020-2028 (1996).
  31. Magiera, M. M., et al. Excessive tubulin polyglutamylation causes neurodegeneration and perturbs neuronal transport. EMBO Journal. 37 (23), 100440 (2018).
  32. Lacroix, B., Janke, C. Generation of differentially polyglutamylated microtubules. Methods in Molecular Biology. 777, 57-69 (2011).
  33. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  34. Magiera, M. M., Janke, C., Correia, J. J., Wilson, L. . Methods in Cell Biology Vol. 115 Microtubules, in vitro. , 247-267 (2013).
  35. Hausrat, T. J., Radwitz, J., Lombino, F. L., Breiden, P., Kneussel, M. Alpha- and beta-tubulin isotypes are differentially expressed during brain development. Developmental Neurobiology. , (2020).
  36. Janke, C., et al. Tubulin polyglutamylase enzymes are members of the TTL domain protein family. Science. 308 (5729), 1758-1762 (2005).
  37. Newton, C. N., et al. Intrinsically slow dynamic instability of HeLa cell microtubules in vitro. Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42456-42462 (2002).
  38. Belvindrah, R., et al. Mutation of the alpha-tubulin Tuba1a leads to straighter microtubules and perturbs neuronal migration. Journal of Cell Biology. 216 (8), 2443-2461 (2017).
  39. Breuss, M., et al. Mutations in the murine homologue of TUBB5 cause microcephaly by perturbing cell cycle progression and inducing p53 associated apoptosis. Development. , (2016).
  40. Latremoliere, A., et al. Neuronal-specific TUBB3 is not required for normal neuronal function but is essential for timely axon regeneration. Cell Reports. 24 (7), 1865-1879 (2018).
  41. Morley, S. J., et al. Acetylated tubulin is essential for touch sensation in mice. Elife. 5, (2016).

Play Video

Cite This Article
Bodakuntla, S., Jijumon, A., Janke, C., Magiera, M. M. Purification of Tubulin with Controlled Posttranslational Modifications and Isotypes from Limited Sources by Polymerization-Depolymerization Cycles. J. Vis. Exp. (165), e61826, doi:10.3791/61826 (2020).

View Video