Summary

טיהור טובולין עם שינויים מבוקרים לאחר טרנסלציה ואיזוטיפים ממקורות מוגבלים על ידי מחזורי פידול-דפולימריזציה

Published: November 05, 2020
doi:

Summary

פרוטוקול זה מתאר טיהור טובולין ממקורות קטנים/בינוניים כגון תאים תרבותיים או מוחות של עכבר יחיד, באמצעות מחזורי פולמור והדפולימוריזציה. טובולין מטוהר מועשר איזוטיפים ספציפיים או יש שינויים פוסט-טרנסלציה ספציפיים והוא יכול לשמש במבחנה reconsays ללמוד דינמיקה microtubule ואינטראקציות.

Abstract

היבט חשוב אחד של מחקרים של ציטוסקלטון microtubule הוא חקירת התנהגות microtubule בניסויים השבת במבחנה. הם מאפשרים ניתוח של המאפיינים המהותיים של microtubules, כגון דינמיקה, ואת האינטראקציות שלהם עם חלבונים הקשורים microtubule (MAPs). “קוד tubulin” הוא מושג המתעוררים המצביע על isotypes טובולין שונים ושינויים פוסט-טרנזיוניים שונים (PTMs) כמו הרגולטורים של תכונות ופונקציות microtubule. כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים של קוד tubulin, זה חיוני לבצע ניסויים reconstitution במבחנה באמצעות tubulin מטוהרים עם isotypes ספציפיים PTMs.

עד כה, זה היה מאתגר מבחינה טכנית כמו tubulin המוח, אשר נעשה שימוש נרחב בניסויים במבחנה, מחסה PTMs רבים ויש לו הרכב איזוטיפ מוגדר. לפיכך, פיתחנו פרוטוקול זה כדי לטהר טובולין ממקורות שונים עם קומפוזיציות איזוטיפ שונות PTMs מבוקר, באמצעות הגישה הקלאסית של מחזורי פולמור והתפרקות. בהשוואה לשיטות קיימות המבוססות על טיהור זיקה, גישה זו מניבה טובולין טהור, בעל יכולת פולמוריזציה, שכן טובולין עמיד בפני פולמור או דפולימריזציה מושלך במהלך שלבי הטיהור העוקבים.

אנו מתארים את הטיהור של טובולין מקווי תאים, גדל או בהשעיה או כמו תרבויות חסידיות, וממוחות עכבר יחיד. השיטה מתארת תחילה את הדור של מסת התא הן בהגדרות ההשעיה והן בהגדרות החסידות, שלב התזה, ואחריו השלבים העוקבים של טיהור טובולין על ידי מחזורי פולמוריזציה-דפולימריזציה. השיטה שלנו מניבה טובולין שניתן להשתמש בו בניסויים העוסקים בהשפעה של קוד טובולין על המאפיינים המהותיים של מיקרוטובולים ואינטראקציות מיקרוטובולה עם חלבונים נלווים.

Introduction

מיקרוטובולות ממלאות תפקידים קריטיים בתהליכים תאיים רבים. הם נותנים לתאים את צורתם, בונים צירים מיוטיים ומיטוטיים להפרדת כרומוזום, ומשמשים מסלולים להובלה תאית. כדי לבצע פונקציות מגוונות אלה, microtubules לארגן את עצמם בדרכים שונות. אחת השאלות המסקרנות בתחום היא להבין את המנגנונים המולקולריים המאפשרים למיקרוטובולים השמורים מבחינה מבנית ואבולוציונית להסתגל לשפע זה של ארגונים ותפקודים. מנגנון פוטנציאלי אחד הוא גיוון של microtubules, אשר מוגדר על ידי המושג המכונה “קוד tubulin”1,2,3. קוד טובולין כולל שני מרכיבים עיקריים: שילוב דיפרנציאלי של מוצרי גנים α ו- β-טובולין (isotypes טובולין) לתוך microtubules ו tubulin שינויים פוסט טראנסלציה (PTMs).

מאז שנות השבעים, ניסויי שחזור במבחנה, בשילוב עם טכניקות מיקרוסקופיות אור מתפתחות, סללו את הדרך לתגליות חשובות על תכונות של מיקרוטובולים: חוסר יציבותדינמית 4 והליכון5, ומנגנונים אחרים שלהם פונקציות6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. כמעט כל הניסויים במבחנה שבוצעו עד כה התבססו על טובולין מטוהר מרקמת המוח באמצעות מחזורים חוזרים ונשנים של פולמור והתפרקות16,17. למרות טיהור מרקמת המוח מעניק את היתרון של קבלת טובולין באיכות גבוהה בכמויות גדולות (בדרך כלל כמויות גרם), חיסרון חשוב אחד הוא הטרוגניות כמו tubulin מטוהרים מרקמת המוח היא תערובת של isotypes טובולין שונים מועשר PTMs טובולין רבים. הטרוגניות זו אינה מאפשרת לציין את תפקידו של טובולין PTM מסוים או איזוטיפ בשליטה על תכונות ופונקציות microtubule. לכן, ייצור tubulin הרכבה מוסמך עם PTMs טובולין מבוקר הרכב isotype הומוגני הוא חיוני כדי לטפל במנגנונים המולקולריים של קוד tubulin.

לאחרונה, גישה לטהר טובולין על ידי כרומטוגרפיה זיקה באמצעות TOG מחייב microtubule (הגן overexpressed הגידול) של שמרים Stu2p פותחה18. בשיטה זו, טובולין ב lysates גס של תאים או רקמה מועבר דרך עמודה שבה הוא נקשר לתחום TOG משותק מטריצה, המאפשר ניתוח של כל מאגר טובולין של נתון, אפילו קטן מאוד, מדגם. גישה המיוחלת לטהר טובולין רקומביננטי תוארה גם בשנים האחרונות. הוא מבוסס על מערכת baculovirus, שבה וקטור דו-סיסטרוני המכיל גנים α ו- β-טובולין מתבטא בתאי חרקים19. עם זאת, שיטה זו היא מסורבלת מאוד זמן רב ולכן משמש בעיקר לחקר ההשפעה של מוטציות tubulin20 ו tubulin isotypes21,22,23 במבחנה.

בפרוטוקול הנוכחי, אנו מתארים שיטה המשתמשת בגישה מבוססת היטב בשימוש נרחב פולימריזציה-depolymerization כשרטוט כדי ליצור tubulin עם רמות שונות של שינוי או מקווי התא או מרקמת המוח העכבר24. בהליך זה, טובולין הוא רכב על אופניים בין מסיס (טובולין דימר ב 4 מעלות צלזיוס) וצורה פולימרית (microtubule ב 30 מעלות צלזיוס בנוכחות guanosine 5′-triphosphate [GTP]). כל צורה מופרדת באמצעות צעדים רצופים של צנטריפוגה: dimers tubulin יישארו supernatant לאחר ספין קר (4 מעלות צלזיוס), ואילו microtubules יהיה גלולות ב 30 מעלות צלזיוס. יתר על כן, צעד אחד של פולמריזציה מתבצע ב piperazine גבוהה-N, N′-bis(2-אתנסולפונית חומצה) (PIPES) ריכוז, המאפשר הסרת חלבונים הקשורים microtubule מן microtubules ובכך, מן טובולין מטוהרים סוף סוף. Tubulin מטוהרים מתאי HeLa S3 גדל כמו השעיה או תרבויות חסידים הוא כמעט ללא כל tubulin PTM והוא שימש לאחרונה בניסויים reconstitution במבחנה25,26,27,28. התאמנו עוד יותר את השיטה לטיהור טובולין ממוחות עכבר יחיד, אשר ניתן להשתמש בהם עבור מספר רב של דגמי עכבר עם שינויים איזוטיפים טובולין ו PTMs.

בפרוטוקול, אנו מתארים תחילה את הדור של חומר המקור (מסת תא או רקמת מוח), את התמוגה שלו (איור 1A), ואחריו את השלבים העוקבים של פולמריזציה של טובולין והתפרקות כדי לטהר את הצינורית(איור 1B). בנוסף, אנו מתארים את התהליך להערכת הטוהר (איור 2א’,ב)ואת הכמות (איור 3א’,ב)של הצינור המטוהר. ניתן להתאים את השיטה לייצור טובולין מועשר ב-PTM נבחר על ידי דיכוי יתר של אנזים משתנה בתאים לפני טיהור הצינורית(איור 4B). לחלופין, ניתן להוסיף אנזימים לשינוי טובולין ל Tubulin במהלך תהליך הטיהור. לבסוף, אנו יכולים לטהר טובולין חסר isotypes ספציפיים או PTMs ממוחם של עכברים לקוי באנזימים המתאימים לשינוי טובולין (איור 4B)29.

לשיטה שאנו מתארים כאן יש שני יתרונות עיקריים: (i) היא מאפשרת ייצור של כמויות גדולות מספיק של טובולין בזמן קצר יחסית, ו-(ii) היא מייצרת טובולין טהור באיכות גבוהה, עם הרכב איזוטיפ צינורי ספציפי או PTMs. בסרטון המשויך לכתב יד זה, אנו מדגישים כמה מהשלבים הקריטיים הכרוכים בהליך זה.

Protocol

הטיפול בבעלי החיים והשימוש במחקר זה בוצעו בהתאם להמלצות הקהילה האירופית (2010/63/UE). הליכים ניסיוניים אושרו באופן ספציפי על ידי ועדת האתיקה של המכון קירי CEEA-IC #118 (אישור מס ‘ 04395.03 שניתן על ידי הרשות הלאומית) בהתאם להנחיות הבינלאומיות. 1. הכנת ריאגנטים לטיהור טובולין ?…

Representative Results

המטרה העיקרית של שיטה זו היא לייצר טובולין איכותי, מוכשר הרכבה בכמויות מספיקות כדי לבצע ניסויים חוזרים ונשנים במבחנה עם הרכיבים המטוהרים. מיקרוטבולים שנאספו מתוך צינורית זו יכולים לשמש במבחני שחזור המבוססים על טכניקת המיקרוסקופיה הכוללת של פלואורסצנטיות השתקפות פנימית (TIRF) עם מיקרוטובו…

Discussion

השיטה המתוארת כאן מספקת פלטפורמה ליצירת טובולין איכותי ומוכשר להרכבה בכמויות בינוניות-גדולות מקווי תאים וממוחות של עכבר יחיד. הוא מבוסס על פרוטוקול תקן זהב של טיהור tubulin ממוחות שור המשמשים בתחום במשך שנים רבות16,17. אחד היתרונות הספציפיים של הגישה הוא השימוש…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי ANR-10-IDEX-0001-02, תא LabEx’n’Scale ANR-11-LBX-0038 ומכון דה התכנסות Q-life ANR-17-CONV-0005. סי.ג’יי נתמך על ידי המכון קירי, סוכנות המחקר הלאומית הצרפתית (ANR) מעניקה ANR-12-BSV2-0007 ו ANR-17-CE13-0021, המכון הלאומי לסרטן (INCA) מענק 2014-PL BIO-11-ICR-1, ואת פונדציה לשפוך la Recherche רפואי (FRM) מענק DEQ2017033676. MMM נתמך על ידי מענק אלצהיימר לשווא פונדציה FR-16055p, ועל ידי צרפת אלצהיימר מענק AAP SM 2019 n ° 2023. JAS נתמכה על ידי תוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי במסגרת הסכם המענק מארי סקלודובסקי-קירי מס’ 675737, ומענק FRM FDT201904008210. SB נתמך על ידי מענק FRM FDT201805005465.

אנו מודים לכל חברי מעבדת ינקה, ובמיוחד לג’יי מרקהרון, כמו גם לג’י לאקיסיק (מכון MICALIS, AgroParisTech) וא. גאוטרו (אקול פוליטכניק) על העזרה במהלך הקמת הפרוטוקול. ברצוננו להודות למתקן החיות של המכון קירי על העזרה בגידול וטיפול בעכבר.

הנוגדן 12G10, שפותח על ידי ג’יי פרנקל ו מ ‘ נלסון, התקבל מבנק Hybridoma מחקרים התפתחותיים שפותח בחסות NICHD ומתוחזק על ידי אוניברסיטת איווה.

Materials

1 M MgCl2  Sigma #M1028
1-L cell culture vessels Techne F7610  Used for spinner cultures. Never stir the empty spinner bottles. When spinner bottles are in the cell culture incubator, always keep the lateral valves of spinner bottles slightly open to facilitate the equilibration of media with incubator’s atmosphere. After use, fill the spinner bottles immediately with tap water to avoid drying of remaining cells on the bottle walls. Wash the bottles with deionised water, add app 200 ml of deionised water and autoclave. Under a sterile cell culture hood remove the water and allow the bottles to dry completely, still under the hood, for several hours. Never use detergents for cleaning the spinner bottles because any trace amounts of the detergent can be deleterious to the cells.
1.5- and 2-ml tubes
14-ml round-bottom tubes
15-cm-diameter sterile culture dishes
15-ml screw-cap tubes
2-mercaptoethanol  Sigma  #M3148 2-mercaptoethanol is toxic and should be used under the hood.
4-(2-aminoethyl)-benzenesulfonyl fluoride  Sigma  #A8456
40% Acrylamide  Bio-Rad  #161-0140
5-, 10- 20-ml syringes
5-ml, 10-ml, 25-ml sterile pipettes
50-ml screw-cap tubes
Ammonium persulfate (APS) Sigma #A3678
Anti-alpha-tubulin antibody, 12G10  Developed by J. Frankel and M. Nelson, obtained from the Developmental Studies Hybridoma Bank, developed under the auspices of the NICHD, and maintained by the University of Iowa dilution: 1/500
Anti-glutamylated tubulin antibody, GT335  AdipoGen  #AG-20B-0020 dilution: 1/20,000
Aprotinin  Sigma  #A1153
Balance (0.1 – 10 g)
Beckman 1-l polypropylene bottles  For collecting spinner cultures
Beckman Avanti J-26 XP centrifuge For collecting spinner cultures
Biological stirrer  Techne MCS-104L  Installed in the cell culture incubator (for spinner cultures), 25 rpm for Hela S3 and HEK 293 cells
Bis N,N’-Methylene-Bis-Acrylamide  Bio-Rad  #161-0201
Blender IKA Ultra-Turrax®  For lysing brain tissue, use 5-mm probe, with the machine set at power 6 or 7. Blend the brain tissue 2-3 times for 15 s on ice.
Bovine serum albumin (BSA) Sigma  #A7906
Bromophenol blue  Sigma  #1.08122
Carboxypeptidase A (CPA) Sigma #C9268 Concentration: 1.7 U/µl
Cell culture hood
Cell culture incubator set at 37°C, 5% CO2
Dimethyl sulfoxide (DMSO)  Sigma  #D8418 DMSO can enhance cell and skin permeability of other compounds. Avoid contact and use skin and eye protection.
DMEM medium  Life Technologies  #41965062
DTT, DL-Dithiothreitol  Sigma  #D9779
EDTA Euromedex #EU0007-C
EGTA Sigma  #E3889
Ethanol absolute  Fisher Chemical  #E/0650DF/15
Fetal bovine serum (FBS) Sigma  #F7524
French pressure cell press  Thermo electron corporation  #FA-078A with a #FA-032 cell; for lysing big amounts of cells. Set at medium ratio, and the gauge pressure of 1,000 psi (corresponds to 3,000 psi inside the disruption chamber).
Glycerol  VWR Chemicals  #24388.295
Glycine Sigma #G8898
GTP  Sigma  #G8877
Heating block  Stuart  #SBH130D
Hela cells  ATCC® CCL-2™
Hela S3 cells  ATCC ATCC® CCL-2.2™
Hydrochloric acid (HCl ) VWR #20252.290
Inverted microscope  With fluorescence if cell transfection is to be verified
Isopropanol  VWR  #20842.298
jetPEI Polyplus  #101
JLA-8.1000 rotor  For collecting spinner cultures
KOH  Sigma  #P1767 KOH is corrosive and causes burns; use eye and skin protection.
L-Glutamine  Life Technologies  #25030123
Laboratory centrifuge for 50-ml tubes Sigma 4-16 K 
Leupeptin  Sigma #L2884
Liquid nitrogen 
Micro-pipettes p2.5, p10, p20, p100, p200 and p1000 and corresponding tips
Micropestles Eppendorf #0030 120.973
Mouse brain tissue  Animal care and use for this study were performed in accordance with the recommendations of the European Community (2010/63/UE). Experimental procedures were specifically approved by the ethics committee of the Institut Curie CEEA-IC #118 (authorization no. 04395.03 given by National Authority) in compliance with the international guidelines.
Needles 18G X 1 ½” (1.2 X 38 mm Terumo #18G
Needles 20G X 1 ½” (0.9 X 38 mm Terumo #20G
Needles 21G X 4 ¾” (0.8 X 120 mm B.Braun #466 5643
Parafilm
PBS  Life Technologies  #14190169
Penicillin-Streptomycin  Life Technologies  #15140130
pH-meter
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Sigma  #P7626 PMSF powder is hazardous. Use skin and eye protection when preparing PMSF solutions.
PIPES  Sigma  #P6757
Pipette-boy
Rotors Beckman 70.1 Ti; TLA-100.3; and TLA 55
SDS-PAGE electrophoresis equipment  Bio-Rad  #1658001FC
SDS, Sodium dodecyl sulphate  VWR  #442444H For preparing Laemmeli buffer 
SDS, Sodium dodecyl sulphate  Sigma  #L5750 For preparing 'TUB' SDS-PAGE gels
Sonicator  Branson #101-148-070 Used for lysing cells grown as adherent cultures. Use 6.5 mm diameter probe, set the sonicator at “Output control” 1, “Duty cycle” 10% and time depending on the cell type used.
Tabletop centrifuge for 1.5 ml tubes Eppendorf 5417R 
TEMED, N, N, N′, N′-Tetramethylethylenediamine  Sigma #9281
Trichostatin A (TSA) Sigma #T8552
Triton X-100  Sigma  #T9284
Trizma base (Tris) Sigma  #T1503
Trypsin  Life Technologies #15090046
Ultracentrifuge rotors  TLA-55, TLA-100.3 and 70.1 Ti rotors Set at 4°C or 30°C based on the need of the experiment 
Ultracentrifuge tubes  Beckman #357448  for using with TLA-55 rotor
Ultracentrifuge tubes  Beckman #349622 for using with TLA-100.3 rotor
Ultracentrifuge tubes  Beckman #355631  for using with 70.1 Ti rotor
Ultracentrifuges Beckman Optima L80-XP (or equivalent) and Optima MAX-XP (or equivalent) Set at 4°C or 30°C based on the need of the experiment 
Vortex mixer
Water bath equipped with floaters or tube holders Set at 30°C 

References

  1. Verhey, K. J., Gaertig, J. The tubulin code. Cell Cycle. 6 (17), 2152-2160 (2007).
  2. Janke, C. The tubulin code: Molecular components, readout mechanisms, and functions. Journal of Cell Biology. 206 (4), 461-472 (2014).
  3. Janke, C., Magiera, M. M. The tubulin code and its role in controlling microtubule properties and functions. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 21 (6), 307-326 (2020).
  4. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
  5. Margolis, R. L., Wilson, L. Opposite end assembly and disassembly of microtubules at steady state in vitro. Cell. 13 (1), 1-8 (1978).
  6. Borisy, G. G., Olmsted, J. B. Nucleated assembly of microtubules in porcine brain extracts. Science. 177 (55), 1196-1197 (1972).
  7. Kirschner, M. W., Williams, R. C. The mechanism of microtubule assembly in vitro. Journal of Supramolecular Structure. 2 (2-4), 412-428 (1974).
  8. Baas, P. W., Lin, S. Hooks and comets: The story of microtubule polarity orientation in the neuron. Developmental Neurobiology. 71 (6), 403-418 (2011).
  9. Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
  10. Nedelec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. Self-organization of microtubules and motors. Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).
  11. Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps. Cell. 142 (3), 420-432 (2010).
  12. Roostalu, J., et al. Directional switching of the kinesin Cin8 through motor coupling. Science. 332 (6025), 94-99 (2011).
  13. Schaedel, L., et al. Microtubules self-repair in response to mechanical stress. Nature Materials. 14 (11), 1156-1163 (2015).
  14. Hendricks, A. G., Goldman, Y. E., Holzbaur, E. L. F. Reconstituting the motility of isolated intracellular cargoes. Methods in Enzymology. 540, 249-262 (2014).
  15. Dogterom, M., Surrey, T. Microtubule organization in vitro. Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 23-29 (2013).
  16. Vallee, R. B. Reversible assembly purification of microtubules without assembly-promoting agents and further purification of tubulin, microtubule-associated proteins, and MAP fragments. Methods in Enzymology. 134, 89-104 (1986).
  17. Castoldi, M., Popov, A. V. Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer. Protein Expression and Purification. 32 (1), 83-88 (2003).
  18. Widlund, P. O., et al. One-step purification of assembly-competent tubulin from diverse eukaryotic sources. Molecular Biology of the Cell. 23 (22), 4393-4401 (2012).
  19. Minoura, I., et al. Overexpression, purification, and functional analysis of recombinant human tubulin dimer. FEBS Letters. 587 (21), 3450-3455 (2013).
  20. Uchimura, S., et al. A flipped ion pair at the dynein-microtubule interface is critical for dynein motility and ATPase activation. Journal of Cell Biology. 208 (2), 211-222 (2015).
  21. Pamula, M. C., Ti, S. C., Kapoor, T. M. The structured core of human beta tubulin confers isotype-specific polymerization properties. Journal of Cell Biology. 213 (4), 425-433 (2016).
  22. Vemu, A., et al. Structure and dynamics of single-isoform recombinant neuronal Human tubulin. Journal of Biological Chemistry. 291 (25), 12907-12915 (2016).
  23. Ti, S. C., Alushin, G. M., Kapoor, T. M. Human beta-tubulin isotypes can regulate microtubule protofilament number and stability. Developmental Cell. 47 (2), 175-190 (2018).
  24. Souphron, J., et al. Purification of tubulin with controlled post-translational modifications by polymerization-depolymerization cycles. Nature Protocols. 14, 1634-1660 (2019).
  25. Barisic, M., et al. Microtubule detyrosination guides chromosomes during mitosis. Science. 348 (6236), 799-803 (2015).
  26. Nirschl, J. J., Magiera, M. M., Lazarus, J. E., Janke, C., Holzbaur, E. L. F. alpha-Tubulin tyrosination and CLIP-170 phosphorylation regulate the initiation of dynein-driven transport in neurons. Cell Reports. 14 (11), 2637-2652 (2016).
  27. Guedes-Dias, P., et al. Kinesin-3 responds to local microtubule dynamics to target synaptic cargo delivery to the presynapse. Current Biology. 29 (2), 268-282 (2019).
  28. Luo, Y., et al. Direct observation of dynamic protein interactions involving human microtubules using solid-state NMR spectroscopy. Nature Communications. 11 (1), 18 (2020).
  29. Even, A., et al. ATAT1-enriched vesicles promote microtubule acetylation via axonal transport. Science Advances. 5 (12), 2705 (2019).
  30. Wolff, J., Sackett, D. L., Knipling, L. Cation selective promotion of tubulin polymerization by alkali metal chlorides. Protein Science. 5 (10), 2020-2028 (1996).
  31. Magiera, M. M., et al. Excessive tubulin polyglutamylation causes neurodegeneration and perturbs neuronal transport. EMBO Journal. 37 (23), 100440 (2018).
  32. Lacroix, B., Janke, C. Generation of differentially polyglutamylated microtubules. Methods in Molecular Biology. 777, 57-69 (2011).
  33. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  34. Magiera, M. M., Janke, C., Correia, J. J., Wilson, L. . Methods in Cell Biology Vol. 115 Microtubules, in vitro. , 247-267 (2013).
  35. Hausrat, T. J., Radwitz, J., Lombino, F. L., Breiden, P., Kneussel, M. Alpha- and beta-tubulin isotypes are differentially expressed during brain development. Developmental Neurobiology. , (2020).
  36. Janke, C., et al. Tubulin polyglutamylase enzymes are members of the TTL domain protein family. Science. 308 (5729), 1758-1762 (2005).
  37. Newton, C. N., et al. Intrinsically slow dynamic instability of HeLa cell microtubules in vitro. Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42456-42462 (2002).
  38. Belvindrah, R., et al. Mutation of the alpha-tubulin Tuba1a leads to straighter microtubules and perturbs neuronal migration. Journal of Cell Biology. 216 (8), 2443-2461 (2017).
  39. Breuss, M., et al. Mutations in the murine homologue of TUBB5 cause microcephaly by perturbing cell cycle progression and inducing p53 associated apoptosis. Development. , (2016).
  40. Latremoliere, A., et al. Neuronal-specific TUBB3 is not required for normal neuronal function but is essential for timely axon regeneration. Cell Reports. 24 (7), 1865-1879 (2018).
  41. Morley, S. J., et al. Acetylated tubulin is essential for touch sensation in mice. Elife. 5, (2016).

Play Video

Cite This Article
Bodakuntla, S., Jijumon, A., Janke, C., Magiera, M. M. Purification of Tubulin with Controlled Posttranslational Modifications and Isotypes from Limited Sources by Polymerization-Depolymerization Cycles. J. Vis. Exp. (165), e61826, doi:10.3791/61826 (2020).

View Video