Summary

Tubulin'in Kontrollü Posttranslational Modifikasyonlar ve Sınırlı Kaynaklardan İzotiplerle Polimerizasyon-Depolimerizasyon Döngüleri ile Saflaştırılması

Published: November 05, 2020
doi:

Summary

Bu protokol, polimerizasyon ve depolimerizasyon döngüleri kullanılarak kültürlü hücreler veya tek fare beyinleri gibi küçük/orta ölçekli kaynaklardan tübulin saflaştırmayı açıklar. Saflaştırılmış tubulin belirli izotiplerde zenginleştirilmiştir veya spesifik posttranslational modifikasyonlara sahiptir ve mikrotübül dinamiklerini ve etkileşimlerini incelemek için in vitro rekonsiyel testlerinde kullanılabilir.

Abstract

Mikrotübül sitoskeleton çalışmalarının önemli bir yönü, in vitro rekonseptüs deneylerinde mikrotübül davranışının araştırılmasıdır. Dinamikler gibi mikrotübüllerin içsel özelliklerinin ve mikrotübül ilişkili proteinlerle (VIP’ ler) etkileşimlerinin analizine izin verirler. “Tübulin kodu”, mikrotübül özelliklerinin ve işlevlerinin düzenleyicileri olarak farklı tubulin izotiplerine ve çeşitli posttranslational değişikliklere (PTM’ ler) işaret eden gelişmekte olan bir kavramdır. Tübulin kodunun moleküler mekanizmalarını keşfetmek için, belirli izotiplere ve PTM’lere sahip saflaştırılmış tubulin kullanarak in vitro rekonste deneyleri yapmak çok önemlidir.

Bugüne kadar, in vitro deneylerde yaygın olarak kullanılan, birçok PTM’yi barındıran ve tanımlanmış bir izotip bileşimine sahip olan beyin tübulini teknik olarak zordu. Bu nedenle, tübulini farklı kaynaklardan ve farklı izotip bileşimleri ve kontrollü PTM’lerden arındırmak için, polimerizasyon ve depolimerizasyon döngülerinin klasik yaklaşımını kullanarak bu protokolü geliştirdik. Benzeşim saflaştırmasına dayanan mevcut yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu yaklaşım saf, polimerizasyona yetkin tübulin verir, çünkü polimerizasyona veya depolimerizasyona dirençli tübulin ardışık saflaştırma adımları sırasında atılır.

Tübulinin hücre çizgilerinden arındırılmasını, süspansiyonda veya bağlı kültürler olarak ve tek fare beyinlerinden tanımlarız. Yöntem ilk olarak hem süspansiyon hem de yapışık ayarlarda hücre kütlesinin neslini, lizis adımını, ardından polimerizasyon-depolimerizasyon döngüleri ile tübulin saflaştırmanın ardışık aşamalarını açıklar. Yöntemimiz, tübulin kodunun mikrotübüllerin içsel özellikleri ve ilişkili proteinlerle mikrotübül etkileşimleri üzerindeki etkisini ele alan deneylerde kullanılabilecek tübulin verir.

Introduction

Mikrotübüller birçok hücresel işlemde kritik roller oynar. Hücrelere şekillerini verirler, kromozom ayrımı için meiotik ve mitotik iğler oluştururlar ve hücre içi taşıma için izler görevi ederler. Bu farklı işlevleri yerine getirmek için mikrotübüller kendilerini farklı şekillerde düzenlerler. Alandaki merak uyandırıcı sorulardan biri, yapısal ve evrimsel olarak korunmuş mikrotübüllerin bu organizasyon ve işlev bolluğuna uyum sağlamasını sağlayan moleküler mekanizmaları anlamaktır. Potansiyel mekanizmalardan biri, ‘tübulin kodu’1,2,3olarak bilinen kavram tarafından tanımlanan mikrotübüllerin çeşitlendirilmesidir. Tubulin kodu iki ana bileşen içerir: α ve β-tubulin gen ürünlerinin (tubulin izotipleri) mikrotübüllere ve tübulin posttranslational modifikasyonlara (PTM’ ler) diferansiyel olarak dahil edildi.

1970’lerden bu yana, in vitro rekonstrüs deneyleri, gelişen ışık mikroskopi teknikleri ile birlikte, mikrotübüllerin özellikleri hakkında önemli keşiflerin önünü açmıştır: dinamik dengesizlik4 ve koşu bandı5ve diğer mekanizmaları ve işlevleri 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. Şimdiye kadar yapılan hemen hemen tüm in vitro deneyler, tekrarlanan polimerizasyon ve depolimerizasyon döngüleri kullanılarak beyin dokusundan saflaştırılmış tübulin bazlıdır16,17. Beyin dokusundan arınma, yüksek kaliteli tübulin elde etmenin avantajını büyük miktarlarda (genellikle gram miktarlar) sağlasa da, beyin dokusundan saflaştırılmış tübulin farklı tubulin izotiplerinin bir karışımı olduğu ve birçok tübulin PTM’si ile zenginleştirilmiş olması nedeniyle önemli bir dezavantaj heterojenliktir. Bu heterojenlik, mikrotübül özelliklerinin ve işlevlerinin kontrolünde belirli bir tübulin PTM’nin veya izotipin rolünü tanımlamayı imkansız kılar. Bu nedenle, tübulin kodunun moleküler mekanizmalarını ele almak için kontrollü tübulin PTM’leri ve homojen izotip bileşimi ile montaja yetkin tubulin üretmek esastır.

Son zamanlarda, maya Stu2p’in mikrotübül bağlayıcı TOG (tümör aşırı ekspresyonlu gen) etki alanını kullanarak tubulin’i benzeşim kromatografisi ile arındırmak için bir yaklaşım geliştirilmiştir18. Bu yöntemde, hücrelerin veya dokunun kabalyatlarındaki tübulin, matris immobilize TOG etki alanına bağlandığı bir sütundan geçirilir, bu da belirli bir, hatta çok küçük bir örneğin tüm tübulin havuzunun analizini sağlar. Rekombinant tübulin saflaştırmak için uzun zamandır beklenen bir yaklaşım da son yıllarda tanımlanmıştır. α ve β-tubulin genleri içeren iki cistronic vektörün böcek hücrelerinde ifade edildiği baculovirüs sistemine dayanmaktadır19. Bununla birlikte, bu yöntem çok hantal ve zaman alıcıdır ve bu nedenle çoğunlukla tubulin mutasyonları20 ve tubulin izotipleri21 , 22,23in vitro etkisini incelemek için kullanılır.

Mevcut protokolde, hücre çizgilerinden veya fare beyin dokusundan farklı modifikasyon seviyelerine sahip tübulin oluşturmak için köklü ve yaygın olarak kullanılan polimerizasyon-depolimerizasyon yaklaşımını kullanan bir yöntemi bir plan olarak tanımlıyoruz24. Bu prosedürde, tübulin çözünür (4 °C’de tübulin dimer) ve polimerize form (guanosin 5′-trifosfat [GTP] varlığında 30 °C’de mikrotübül) arasında döngüye girer. Her form ardışık santrifüjleme adımlarıyla ayrılır: tübulin dimerler soğuk (4 °C) bir dönüşten sonra süpernatanta kalırken, mikrotübüller 30 ° C’de peletlenecektir. Ayrıca, mikrotübül ilişkili proteinlerin mikrotübüllerden ve böylece son olarak saflaştırılmış tübulinden uzaklaştırılmasını sağlayan yüksek piperazin-N,N′-bis(2-etanesülfonic asit) (PIPES) konsantrasyonda bir polimerizasyon adımı gerçekleştirilir. Süspansiyon veya yapışık kültürler olarak yetiştirilen HeLa S3 hücrelerinden arındırılmış Tubulin, herhangi bir tübulin PTM’sinden neredeyse ücretsizdir ve son in vitro reconstitution deneylerindekullanılmıştır 25,26,27,28. Tubulin izotiplerinde ve PTM’lerde değişikliklerle çok sayıda fare modeli için kullanılabilecek tubulin’i tek fare beyinlerinden arındırma yöntemini daha da uyarladık.

Protokolde, ilk olarak kaynak materyalin (hücre kütlesi veya beyin dokusu), lizizinin(Şekil 1A)neslini ve ardından tübulini arındırmak için tübulin polimerizasyonu ve depolimerizasyonunun ardışık adımlarını açıklıyoruz (Şekil 1B). Saflaştırılmış tübulinin saflığını (Şekil 2A,B) ve miktarını (Şekil 3A,B) değerlendirmek için süreci daha ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Yöntem, tübulin saflaştırmadan önce hücrelerde bir modifiye enzimi aşırı ifade ederek seçilen bir PTM ile zenginleştirilmiş tübulin üretmek için uyarlanabilir (Şekil 4B). Alternatif olarak, saflaştırma işlemi sırasında tübulin modifiye edici enzimler tubulin eklenebilir. Son olarak, spesifik izotiplerden veya PTM’lerden yoksun tübulini, ilgili tübulin değiştirici enzimlerde eksik olan farelerin beyinlerinden arındırabiliriz (Şekil 4B)29.

Burada tarif ettiğimiz yöntemin iki temel avantajı vardır: (i) nispeten kısa sürede yeterince büyük miktarlarda tübulin üretimine izin verir ve (ii) spesifik tubulin izotip bileşimi veya PTM’leri ile yüksek kaliteli, saf tubulin üretir. Bu makalenin ilişkili videosunda, bu prosedürde yer alan bazı kritik adımları vurguluyoruz.

Protocol

Hayvan bakımı ve bu çalışma için kullanımı Avrupa Topluluğu’nun önerileri doğrultusunda (2010/63/UE) gerçek gerçekleştirildi. Deneysel prosedürler, Uluslararası yönergelere uygun olarak Institut Curie CEEA-IC #118 etik komitesi (Ulusal Otorite tarafından verilen 04395.03 yetki) tarafından özel olarak onaylanmıştır. 1. Tübulin Saflaştırması için Reaktiflerin Hazırlanması NOT: Tübulin saflaştırması için kullanılan tüm tamponlar potas…

Representative Results

Bu yöntemin temel amacı, saflaştırılmış bileşenlerle tekrarlanan in vitro deneyler yapmak için yeterli miktarlarda yüksek kaliteli, montaja yetkin tubulin üretmektir. Bu tübulinden monte edilen mikrotübüller, dinamik veya kararlı mikrotübüller ile toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskopi tekniğine dayalı rekonstrüt tahlillerinde, mikrotübül dinamiklerini test eden deneylerde, MAP’ler veya moleküler motorlarla etkileşimlerde ve motorlar tarafından kuvvet üretiminde kullanılabilir<sup class…

Discussion

Burada açıklanan yöntem, hücre çizgilerinden ve tek fare beyinlerinden orta-büyük miktarlarda hızlı bir şekilde yüksek kaliteli, montaj yetkin tubulin üretmek için bir platform sağlar. Uzun yıllardır sahada kullanılan sığır beyinlerinden tübulin saflaştırmanın altın standart protokolüne dayanmaktadır16,17. Yaklaşımın özel bir avantajı, kurulduktan sonra çok az uygulamalı zaman gerektirirken büyük miktarlarda hücre üreten HeLa…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma ANR-10-IDEX-0001-02, LabEx Cell’n’Scale ANR-11-LBX-0038 ve Institut de convergence Q-life ANR-17-CONV-0005 tarafından desteklenmiştir. CJ, Institut Curie tarafından desteklenmektedir, Fransız Ulusal Araştırma Ajansı (ANR) ANR-12-BSV2-0007 ve ANR-17-CE13-0021 ödüllerini, Institut National du Cancer (INCA) hibe 2014-PL BIO-11-ICR-1 ve Fondation pour la Recherche Medicale (FRM) hibe DEQ20170336756. MMM, Fondation Vaincre Alzheimer hibeSI FR-16055p ve Fransa Alzheimer hibesi AAP SM 2019 n°2023 tarafından desteklenmektedir. JAS, Marie Skłodowska-Curie hibe anlaşması No 675737 ve FRM hibe FDT201904008210 kapsamında Avrupa Birliği’nin Horizon 2020 araştırma ve yenilik programı tarafından desteklenmiştir. SB, FRM hibesi FDT201805005465 tarafından desteklenmiştir.

Janke laboratuvarının tüm üyelerine, özellikle J. Souphron’a, G. Lakisic’e (Institut MICALIS, AgroParisTech) ve A. Gautreau’ya (Ecole Polytechnique) protokolün kurulması sırasında yardımları için teşekkür ederiz. Institut Curie hayvan tesisine fare yetiştiriciliği ve bakımı konusunda yardımları için teşekkür ederiz.

J. Frankel ve M. Nelson tarafından geliştirilen 12G10 antikor, NICHD himayesinde geliştirilen ve Iowa Üniversitesi tarafından sürdürülen Gelişimsel Çalışmalar Hybridoma Bankası’ndan elde edildi.

Materials

1 M MgCl2  Sigma #M1028
1-L cell culture vessels Techne F7610  Used for spinner cultures. Never stir the empty spinner bottles. When spinner bottles are in the cell culture incubator, always keep the lateral valves of spinner bottles slightly open to facilitate the equilibration of media with incubator’s atmosphere. After use, fill the spinner bottles immediately with tap water to avoid drying of remaining cells on the bottle walls. Wash the bottles with deionised water, add app 200 ml of deionised water and autoclave. Under a sterile cell culture hood remove the water and allow the bottles to dry completely, still under the hood, for several hours. Never use detergents for cleaning the spinner bottles because any trace amounts of the detergent can be deleterious to the cells.
1.5- and 2-ml tubes
14-ml round-bottom tubes
15-cm-diameter sterile culture dishes
15-ml screw-cap tubes
2-mercaptoethanol  Sigma  #M3148 2-mercaptoethanol is toxic and should be used under the hood.
4-(2-aminoethyl)-benzenesulfonyl fluoride  Sigma  #A8456
40% Acrylamide  Bio-Rad  #161-0140
5-, 10- 20-ml syringes
5-ml, 10-ml, 25-ml sterile pipettes
50-ml screw-cap tubes
Ammonium persulfate (APS) Sigma #A3678
Anti-alpha-tubulin antibody, 12G10  Developed by J. Frankel and M. Nelson, obtained from the Developmental Studies Hybridoma Bank, developed under the auspices of the NICHD, and maintained by the University of Iowa dilution: 1/500
Anti-glutamylated tubulin antibody, GT335  AdipoGen  #AG-20B-0020 dilution: 1/20,000
Aprotinin  Sigma  #A1153
Balance (0.1 – 10 g)
Beckman 1-l polypropylene bottles  For collecting spinner cultures
Beckman Avanti J-26 XP centrifuge For collecting spinner cultures
Biological stirrer  Techne MCS-104L  Installed in the cell culture incubator (for spinner cultures), 25 rpm for Hela S3 and HEK 293 cells
Bis N,N’-Methylene-Bis-Acrylamide  Bio-Rad  #161-0201
Blender IKA Ultra-Turrax®  For lysing brain tissue, use 5-mm probe, with the machine set at power 6 or 7. Blend the brain tissue 2-3 times for 15 s on ice.
Bovine serum albumin (BSA) Sigma  #A7906
Bromophenol blue  Sigma  #1.08122
Carboxypeptidase A (CPA) Sigma #C9268 Concentration: 1.7 U/µl
Cell culture hood
Cell culture incubator set at 37°C, 5% CO2
Dimethyl sulfoxide (DMSO)  Sigma  #D8418 DMSO can enhance cell and skin permeability of other compounds. Avoid contact and use skin and eye protection.
DMEM medium  Life Technologies  #41965062
DTT, DL-Dithiothreitol  Sigma  #D9779
EDTA Euromedex #EU0007-C
EGTA Sigma  #E3889
Ethanol absolute  Fisher Chemical  #E/0650DF/15
Fetal bovine serum (FBS) Sigma  #F7524
French pressure cell press  Thermo electron corporation  #FA-078A with a #FA-032 cell; for lysing big amounts of cells. Set at medium ratio, and the gauge pressure of 1,000 psi (corresponds to 3,000 psi inside the disruption chamber).
Glycerol  VWR Chemicals  #24388.295
Glycine Sigma #G8898
GTP  Sigma  #G8877
Heating block  Stuart  #SBH130D
Hela cells  ATCC® CCL-2™
Hela S3 cells  ATCC ATCC® CCL-2.2™
Hydrochloric acid (HCl ) VWR #20252.290
Inverted microscope  With fluorescence if cell transfection is to be verified
Isopropanol  VWR  #20842.298
jetPEI Polyplus  #101
JLA-8.1000 rotor  For collecting spinner cultures
KOH  Sigma  #P1767 KOH is corrosive and causes burns; use eye and skin protection.
L-Glutamine  Life Technologies  #25030123
Laboratory centrifuge for 50-ml tubes Sigma 4-16 K 
Leupeptin  Sigma #L2884
Liquid nitrogen 
Micro-pipettes p2.5, p10, p20, p100, p200 and p1000 and corresponding tips
Micropestles Eppendorf #0030 120.973
Mouse brain tissue  Animal care and use for this study were performed in accordance with the recommendations of the European Community (2010/63/UE). Experimental procedures were specifically approved by the ethics committee of the Institut Curie CEEA-IC #118 (authorization no. 04395.03 given by National Authority) in compliance with the international guidelines.
Needles 18G X 1 ½” (1.2 X 38 mm Terumo #18G
Needles 20G X 1 ½” (0.9 X 38 mm Terumo #20G
Needles 21G X 4 ¾” (0.8 X 120 mm B.Braun #466 5643
Parafilm
PBS  Life Technologies  #14190169
Penicillin-Streptomycin  Life Technologies  #15140130
pH-meter
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Sigma  #P7626 PMSF powder is hazardous. Use skin and eye protection when preparing PMSF solutions.
PIPES  Sigma  #P6757
Pipette-boy
Rotors Beckman 70.1 Ti; TLA-100.3; and TLA 55
SDS-PAGE electrophoresis equipment  Bio-Rad  #1658001FC
SDS, Sodium dodecyl sulphate  VWR  #442444H For preparing Laemmeli buffer 
SDS, Sodium dodecyl sulphate  Sigma  #L5750 For preparing 'TUB' SDS-PAGE gels
Sonicator  Branson #101-148-070 Used for lysing cells grown as adherent cultures. Use 6.5 mm diameter probe, set the sonicator at “Output control” 1, “Duty cycle” 10% and time depending on the cell type used.
Tabletop centrifuge for 1.5 ml tubes Eppendorf 5417R 
TEMED, N, N, N′, N′-Tetramethylethylenediamine  Sigma #9281
Trichostatin A (TSA) Sigma #T8552
Triton X-100  Sigma  #T9284
Trizma base (Tris) Sigma  #T1503
Trypsin  Life Technologies #15090046
Ultracentrifuge rotors  TLA-55, TLA-100.3 and 70.1 Ti rotors Set at 4°C or 30°C based on the need of the experiment 
Ultracentrifuge tubes  Beckman #357448  for using with TLA-55 rotor
Ultracentrifuge tubes  Beckman #349622 for using with TLA-100.3 rotor
Ultracentrifuge tubes  Beckman #355631  for using with 70.1 Ti rotor
Ultracentrifuges Beckman Optima L80-XP (or equivalent) and Optima MAX-XP (or equivalent) Set at 4°C or 30°C based on the need of the experiment 
Vortex mixer
Water bath equipped with floaters or tube holders Set at 30°C 

References

  1. Verhey, K. J., Gaertig, J. The tubulin code. Cell Cycle. 6 (17), 2152-2160 (2007).
  2. Janke, C. The tubulin code: Molecular components, readout mechanisms, and functions. Journal of Cell Biology. 206 (4), 461-472 (2014).
  3. Janke, C., Magiera, M. M. The tubulin code and its role in controlling microtubule properties and functions. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 21 (6), 307-326 (2020).
  4. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
  5. Margolis, R. L., Wilson, L. Opposite end assembly and disassembly of microtubules at steady state in vitro. Cell. 13 (1), 1-8 (1978).
  6. Borisy, G. G., Olmsted, J. B. Nucleated assembly of microtubules in porcine brain extracts. Science. 177 (55), 1196-1197 (1972).
  7. Kirschner, M. W., Williams, R. C. The mechanism of microtubule assembly in vitro. Journal of Supramolecular Structure. 2 (2-4), 412-428 (1974).
  8. Baas, P. W., Lin, S. Hooks and comets: The story of microtubule polarity orientation in the neuron. Developmental Neurobiology. 71 (6), 403-418 (2011).
  9. Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
  10. Nedelec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. Self-organization of microtubules and motors. Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).
  11. Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps. Cell. 142 (3), 420-432 (2010).
  12. Roostalu, J., et al. Directional switching of the kinesin Cin8 through motor coupling. Science. 332 (6025), 94-99 (2011).
  13. Schaedel, L., et al. Microtubules self-repair in response to mechanical stress. Nature Materials. 14 (11), 1156-1163 (2015).
  14. Hendricks, A. G., Goldman, Y. E., Holzbaur, E. L. F. Reconstituting the motility of isolated intracellular cargoes. Methods in Enzymology. 540, 249-262 (2014).
  15. Dogterom, M., Surrey, T. Microtubule organization in vitro. Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 23-29 (2013).
  16. Vallee, R. B. Reversible assembly purification of microtubules without assembly-promoting agents and further purification of tubulin, microtubule-associated proteins, and MAP fragments. Methods in Enzymology. 134, 89-104 (1986).
  17. Castoldi, M., Popov, A. V. Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer. Protein Expression and Purification. 32 (1), 83-88 (2003).
  18. Widlund, P. O., et al. One-step purification of assembly-competent tubulin from diverse eukaryotic sources. Molecular Biology of the Cell. 23 (22), 4393-4401 (2012).
  19. Minoura, I., et al. Overexpression, purification, and functional analysis of recombinant human tubulin dimer. FEBS Letters. 587 (21), 3450-3455 (2013).
  20. Uchimura, S., et al. A flipped ion pair at the dynein-microtubule interface is critical for dynein motility and ATPase activation. Journal of Cell Biology. 208 (2), 211-222 (2015).
  21. Pamula, M. C., Ti, S. C., Kapoor, T. M. The structured core of human beta tubulin confers isotype-specific polymerization properties. Journal of Cell Biology. 213 (4), 425-433 (2016).
  22. Vemu, A., et al. Structure and dynamics of single-isoform recombinant neuronal Human tubulin. Journal of Biological Chemistry. 291 (25), 12907-12915 (2016).
  23. Ti, S. C., Alushin, G. M., Kapoor, T. M. Human beta-tubulin isotypes can regulate microtubule protofilament number and stability. Developmental Cell. 47 (2), 175-190 (2018).
  24. Souphron, J., et al. Purification of tubulin with controlled post-translational modifications by polymerization-depolymerization cycles. Nature Protocols. 14, 1634-1660 (2019).
  25. Barisic, M., et al. Microtubule detyrosination guides chromosomes during mitosis. Science. 348 (6236), 799-803 (2015).
  26. Nirschl, J. J., Magiera, M. M., Lazarus, J. E., Janke, C., Holzbaur, E. L. F. alpha-Tubulin tyrosination and CLIP-170 phosphorylation regulate the initiation of dynein-driven transport in neurons. Cell Reports. 14 (11), 2637-2652 (2016).
  27. Guedes-Dias, P., et al. Kinesin-3 responds to local microtubule dynamics to target synaptic cargo delivery to the presynapse. Current Biology. 29 (2), 268-282 (2019).
  28. Luo, Y., et al. Direct observation of dynamic protein interactions involving human microtubules using solid-state NMR spectroscopy. Nature Communications. 11 (1), 18 (2020).
  29. Even, A., et al. ATAT1-enriched vesicles promote microtubule acetylation via axonal transport. Science Advances. 5 (12), 2705 (2019).
  30. Wolff, J., Sackett, D. L., Knipling, L. Cation selective promotion of tubulin polymerization by alkali metal chlorides. Protein Science. 5 (10), 2020-2028 (1996).
  31. Magiera, M. M., et al. Excessive tubulin polyglutamylation causes neurodegeneration and perturbs neuronal transport. EMBO Journal. 37 (23), 100440 (2018).
  32. Lacroix, B., Janke, C. Generation of differentially polyglutamylated microtubules. Methods in Molecular Biology. 777, 57-69 (2011).
  33. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  34. Magiera, M. M., Janke, C., Correia, J. J., Wilson, L. . Methods in Cell Biology Vol. 115 Microtubules, in vitro. , 247-267 (2013).
  35. Hausrat, T. J., Radwitz, J., Lombino, F. L., Breiden, P., Kneussel, M. Alpha- and beta-tubulin isotypes are differentially expressed during brain development. Developmental Neurobiology. , (2020).
  36. Janke, C., et al. Tubulin polyglutamylase enzymes are members of the TTL domain protein family. Science. 308 (5729), 1758-1762 (2005).
  37. Newton, C. N., et al. Intrinsically slow dynamic instability of HeLa cell microtubules in vitro. Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42456-42462 (2002).
  38. Belvindrah, R., et al. Mutation of the alpha-tubulin Tuba1a leads to straighter microtubules and perturbs neuronal migration. Journal of Cell Biology. 216 (8), 2443-2461 (2017).
  39. Breuss, M., et al. Mutations in the murine homologue of TUBB5 cause microcephaly by perturbing cell cycle progression and inducing p53 associated apoptosis. Development. , (2016).
  40. Latremoliere, A., et al. Neuronal-specific TUBB3 is not required for normal neuronal function but is essential for timely axon regeneration. Cell Reports. 24 (7), 1865-1879 (2018).
  41. Morley, S. J., et al. Acetylated tubulin is essential for touch sensation in mice. Elife. 5, (2016).

Play Video

Cite This Article
Bodakuntla, S., Jijumon, A., Janke, C., Magiera, M. M. Purification of Tubulin with Controlled Posttranslational Modifications and Isotypes from Limited Sources by Polymerization-Depolymerization Cycles. J. Vis. Exp. (165), e61826, doi:10.3791/61826 (2020).

View Video