Summary

Purificação de Tubulin com Modificações Pós-Translacionais Controladas e Isótipos de Fontes Limitadas por Ciclos de Polimerização-Despolimerização

Published: November 05, 2020
doi:

Summary

Este protocolo descreve a purificação de tubulinas a partir de fontes de pequena/média escala, como células cultivadas ou cérebros de camundongos únicos, usando ciclos de polimerização e despomerização. A tubulina purificada é enriquecida em isótipos específicos ou tem modificações pós-transacionais específicas e pode ser usada em ensaios de reconstituição in vitro para estudar dinâmicas e interações de microtúbulos.

Abstract

Um aspecto importante dos estudos do citoesqueleto microtúbulo é a investigação do comportamento microtúbulo em experimentos de reconstituição in vitro. Permitem a análise das propriedades intrínsecas dos microtúbulos, como a dinâmica, e suas interações com proteínas associadas a microtúbulos (MAPs). O “código tubulina” é um conceito emergente que aponta diferentes isótipos de tubulina e várias modificações pós-transacionais (PTMs) como reguladores de propriedades e funções de microtúbulos. Para explorar os mecanismos moleculares do código tubulina, é crucial realizar experimentos de reconstituição in vitro usando tubulina purificada com isótipos específicos e PTMs.

Até hoje, isso foi tecnicamente desafiador como tubulina cerebral, que é amplamente utilizada em experimentos in vitro, abriga muitos PTMs e tem uma composição de isótipo definida. Assim, desenvolvemos este protocolo para purificar tubulina de diferentes fontes e com diferentes composições isótipos e PTMs controlados, utilizando a abordagem clássica dos ciclos de polimerização e despomerização. Em comparação com os métodos existentes baseados na purificação da afinidade, essa abordagem produz tubulina pura e competente para polimerização, uma vez que a tubulina resistente à polimerização ou despomerização é descartada durante as sucessivas etapas de purificação.

Descrevemos a purificação da tubulina das linhas celulares, cultivadas em suspensão ou como culturas aderentes, e de cérebros de camundongos únicos. O método descreve pela primeira vez a geração de massa celular tanto em configurações de suspensão quanto aderentes, a etapa de lise, seguida pelos sucessivos estágios de purificação da tubulina por ciclos de polimerização-despomerização. Nosso método produz tubulina que pode ser usada em experimentos que abordam o impacto do código tubulina nas propriedades intrínsecas de microtúbulos e interações microtúbulas com proteínas associadas.

Introduction

Os microtúbulos desempenham papéis críticos em muitos processos celulares. Eles dão às células sua forma, constroem fusos meioticos e mitóticos para segregação de cromossomo, e servem como trilhas para o transporte intracelular. Para desempenhar essas diversas funções, os microtúbulos se organizam de diferentes formas. Uma das questões intrigantes no campo é entender os mecanismos moleculares que permitem que os microtúbulos conservados estrutural e evolutivamente se adaptem a essa infinidade de organizações e funções. Um mecanismo potencial é a diversificação de microtúbulos, que é definido pelo conceito conhecido como ‘código tubulina’1,2,3. O código da tubulina inclui dois componentes principais: incorporação diferencial de produtos genéticos α e β-tubulin (isótipos de tubulina) nos microtúbulos e modificações pós-translationais de tubulina (PTMs).

Desde a década de 1970, experimentos de reconstituição in vitro, combinados com técnicas de microscopia de luz em evolução, abriram caminho para importantes descobertas sobre as propriedades dos microtúbulos: instabilidade dinâmica4 e esteira5, e seus outros mecanismos e funções6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. Quase todos os experimentos in vitro realizados até agora foram baseados em tubulina purificada do tecido cerebral usando ciclos repetidos de polimerização e despomerização16,17. Embora a purificação do tecido cerebral confere a vantagem de obter tubulina de alta qualidade em grandes quantidades (geralmente quantidades gramais), uma desvantagem importante é a heterogeneidade como tubulina purificada do tecido cerebral é uma mistura de diferentes isótipos de tubulina e é enriquecida com muitos PTMs de tubulina. Essa heterogeneidade torna impossível delinear o papel de um determinado tubulin PTM ou isótipo no controle de propriedades e funções de microtúbulos. Assim, produzir tubulina competente para montagem com PTMs de tubulina controlada e composição homogênea do isótipo é essencial para abordar os mecanismos moleculares do código tubulina.

Recentemente, uma abordagem para purificar a tubulina por cromatografia de afinidade usando o domínio TOG (gene ultraexpresso de tumor) do domínio de levedura Stu2p foi desenvolvida18. Neste método, a tubulina em lises brutas de células ou tecidos é passada através de uma coluna onde se liga ao domínio TOG imobilizado de matriz, que permite a análise de toda a piscina de tubulina de uma determinada, mesmo muito pequena, amostra. Uma abordagem muito esperada para purificar a tubulina recombinante também foi descrita nos últimos anos. Baseia-se no sistema de baculovírus, no qual um vetor bi-cistrônico contendo genes α e β-tubulina é expresso em células de insetos19. No entanto, este método é muito complicado e demorado e, portanto, é usado principalmente para estudar o impacto das mutações de tubulina20 e isótipos de tubulina21,22,23 in vitro.

No protocolo atual, descrevemos um método que utiliza a abordagem de polimerização-despolimerização bem estabelecida e amplamente utilizada como um projeto para gerar tubulina com diferentes níveis de modificação, seja a partir de linhas celulares ou do tecido cerebral do rato24. Neste procedimento, a tubulina é ciclo entre o solúvel (tubulin dimer a 4 °C) e a forma polimerizada (microtúbulo a 30 °C na presença de guanosina 5′-triphosphate [GTP]). Cada forma é separada através de sucessivas etapas de centrifugação: os dimers de tubulina permanecerão no supernascer após um giro frio (4 °C), enquanto os microtúbulos serão pelotados a 30 °C. Além disso, uma etapa de polimerização é realizada na alta piperazina-N,N‘-bis (2-ácido etanolfônico) (PIPES), que permite a remoção de proteínas associadas a microtúbulos dos microtúbulos e, portanto, da tubulina finalmente purificada. Tubulin purificado de células HeLa S3 cultivadas como culturas suspensas ou aderentes está virtualmente livre de qualquer tubulina PTM e tem sido usada em recentes experimentos de reconstituição in vitro25,26,27,28. Adaptamos ainda mais o método para purificar tubulina de cérebros de camundongos únicos, que podem ser usados para um grande número de modelos de mouse com alterações em isótipos de tubulina e PTMs.

No protocolo, descrevemos pela primeira vez a geração do material de origem (massa celular ou tecido cerebral), sua lise (Figura 1A),seguida dos sucessivos passos de polimerização e despomerização da tubulina para purificar a tubulina (Figura 1B). Descrevemos ainda o processo para avaliar a pureza (Figura 2A,B) e a quantidade(Figura 3A,B) da tubulina purificada. O método pode ser adaptado para produzir tubulina enriquecida com um PTM selecionado, superexpressando uma enzima modificadora em células antes da purificação da tubulina(Figura 4B). Alternativamente, enzimas modificadoras de tubulina podem ser adicionadas à tubulina durante o processo de purificação. Finalmente, podemos purificar tubulinas sem isótipos específicos ou PTMs do cérebro de camundongos deficientes nas enzimas correspondentes modificadoras de tubulina(Figura 4B)29.

O método que descrevemos aqui tem duas principais vantagens: (i) permite a produção de quantidades suficientemente grandes de tubulina em um tempo relativamente curto, e (ii) gera tubulina pura e de alta qualidade, com composição específica de isótipo de tubulina ou PTMs. No vídeo associado deste manuscrito, destacamos algumas das etapas críticas envolvidas neste procedimento.

Protocol

O cuidado e o uso dos animais para este estudo foram realizados de acordo com as recomendações da Comunidade Europeia (2010/63/UE). Os procedimentos experimentais foram especificamente aprovados pelo comitê de ética do Institut Curie CEEA-IC #118 (autorização nº 04395.03 dada pela Autoridade Nacional) em conformidade com as diretrizes internacionais. 1. Preparação de reagentes para purificação de tubulina NOTA: Todos os tampões utilizados para a purificaç…

Representative Results

O principal objetivo deste método é produzir tubulina de alta qualidade e competente para montagem em quantidades suficientes para realizar experimentos in vitro repetidos com os componentes purificados. Microtúbulos montados a partir deste tubúnel pode ser usado em ensaios de reconstituição baseados na técnica total de microscopia de reflexão interna (TIRF) com microtúbulos dinâmicos ou estáveis, em experimentos testando dinâmicas de microtúbulos, interações com MAPs ou motores moleculares, e geração de…

Discussion

O método descrito aqui fornece uma plataforma para gerar rapidamente tubulina de alta qualidade e competente para montagem em quantidades médias-grandes de linhas celulares e cérebros de camundongos únicos. Baseia-se no protocolo padrão-ouro da purificação de tubulinas de cérebros bovinos usados no campo por muitos anos16,17. Uma vantagem particular da abordagem é o uso de culturas de suspensão das células HeLa S3, que, uma vez estabelecidas, produzem …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelo ANR-10-IDEX-0001-02, o LabEx Cell’n’Scale ANR-11-LBX-0038 e o Institut de convergência Q-life ANR-17-CONV-0005. CJ é apoiado pelo Institut Curie, a Agência Nacional de Pesquisa Francesa (ANR) concede ANR-12-BSV2-0007 e ANR-17-CE13-0021, o Institut National du Cancer (INCA) concede 2014-PL BIO-11-ICR-1, e a Fondation pour la Recherche Medicale (FRM) concede de desconto deQ20170336756. O MMM é apoiado pela fondation vaincre Alzheimer grant FR-16055p, e pela França Alzheimer grant AAP SM 2019 n°2023. A JAS foi apoiada pelo programa de pesquisa e inovação Horizon 2020 da União Europeia sob o acordo de subvenção Marie Skłodowska-Curie nº 675737, e a concessão da FRM FDT201904008210. A SB foi apoiada pela subvenção FRM FDT201805005465.

Agradecemos a todos os membros do laboratório Janke, em especial J. Souphron, bem como g. Lakisic (Institut MICALIS, AgroParisTech) e A. Gautreau (Ecole Polytechnique) pela ajuda durante a criação do protocolo. Gostaríamos de agradecer à instalação animal do Institut Curie pela ajuda com a criação e cuidado dos camundongos.

O anticorpo 12G10, desenvolvido por J. Frankel e M. Nelson, foi obtido do Banco hybridoma de estudos de desenvolvimento desenvolvido sob os auspícios do NICHD e mantido pela Universidade de Iowa.

Materials

1 M MgCl2  Sigma #M1028
1-L cell culture vessels Techne F7610  Used for spinner cultures. Never stir the empty spinner bottles. When spinner bottles are in the cell culture incubator, always keep the lateral valves of spinner bottles slightly open to facilitate the equilibration of media with incubator’s atmosphere. After use, fill the spinner bottles immediately with tap water to avoid drying of remaining cells on the bottle walls. Wash the bottles with deionised water, add app 200 ml of deionised water and autoclave. Under a sterile cell culture hood remove the water and allow the bottles to dry completely, still under the hood, for several hours. Never use detergents for cleaning the spinner bottles because any trace amounts of the detergent can be deleterious to the cells.
1.5- and 2-ml tubes
14-ml round-bottom tubes
15-cm-diameter sterile culture dishes
15-ml screw-cap tubes
2-mercaptoethanol  Sigma  #M3148 2-mercaptoethanol is toxic and should be used under the hood.
4-(2-aminoethyl)-benzenesulfonyl fluoride  Sigma  #A8456
40% Acrylamide  Bio-Rad  #161-0140
5-, 10- 20-ml syringes
5-ml, 10-ml, 25-ml sterile pipettes
50-ml screw-cap tubes
Ammonium persulfate (APS) Sigma #A3678
Anti-alpha-tubulin antibody, 12G10  Developed by J. Frankel and M. Nelson, obtained from the Developmental Studies Hybridoma Bank, developed under the auspices of the NICHD, and maintained by the University of Iowa dilution: 1/500
Anti-glutamylated tubulin antibody, GT335  AdipoGen  #AG-20B-0020 dilution: 1/20,000
Aprotinin  Sigma  #A1153
Balance (0.1 – 10 g)
Beckman 1-l polypropylene bottles  For collecting spinner cultures
Beckman Avanti J-26 XP centrifuge For collecting spinner cultures
Biological stirrer  Techne MCS-104L  Installed in the cell culture incubator (for spinner cultures), 25 rpm for Hela S3 and HEK 293 cells
Bis N,N’-Methylene-Bis-Acrylamide  Bio-Rad  #161-0201
Blender IKA Ultra-Turrax®  For lysing brain tissue, use 5-mm probe, with the machine set at power 6 or 7. Blend the brain tissue 2-3 times for 15 s on ice.
Bovine serum albumin (BSA) Sigma  #A7906
Bromophenol blue  Sigma  #1.08122
Carboxypeptidase A (CPA) Sigma #C9268 Concentration: 1.7 U/µl
Cell culture hood
Cell culture incubator set at 37°C, 5% CO2
Dimethyl sulfoxide (DMSO)  Sigma  #D8418 DMSO can enhance cell and skin permeability of other compounds. Avoid contact and use skin and eye protection.
DMEM medium  Life Technologies  #41965062
DTT, DL-Dithiothreitol  Sigma  #D9779
EDTA Euromedex #EU0007-C
EGTA Sigma  #E3889
Ethanol absolute  Fisher Chemical  #E/0650DF/15
Fetal bovine serum (FBS) Sigma  #F7524
French pressure cell press  Thermo electron corporation  #FA-078A with a #FA-032 cell; for lysing big amounts of cells. Set at medium ratio, and the gauge pressure of 1,000 psi (corresponds to 3,000 psi inside the disruption chamber).
Glycerol  VWR Chemicals  #24388.295
Glycine Sigma #G8898
GTP  Sigma  #G8877
Heating block  Stuart  #SBH130D
Hela cells  ATCC® CCL-2™
Hela S3 cells  ATCC ATCC® CCL-2.2™
Hydrochloric acid (HCl ) VWR #20252.290
Inverted microscope  With fluorescence if cell transfection is to be verified
Isopropanol  VWR  #20842.298
jetPEI Polyplus  #101
JLA-8.1000 rotor  For collecting spinner cultures
KOH  Sigma  #P1767 KOH is corrosive and causes burns; use eye and skin protection.
L-Glutamine  Life Technologies  #25030123
Laboratory centrifuge for 50-ml tubes Sigma 4-16 K 
Leupeptin  Sigma #L2884
Liquid nitrogen 
Micro-pipettes p2.5, p10, p20, p100, p200 and p1000 and corresponding tips
Micropestles Eppendorf #0030 120.973
Mouse brain tissue  Animal care and use for this study were performed in accordance with the recommendations of the European Community (2010/63/UE). Experimental procedures were specifically approved by the ethics committee of the Institut Curie CEEA-IC #118 (authorization no. 04395.03 given by National Authority) in compliance with the international guidelines.
Needles 18G X 1 ½” (1.2 X 38 mm Terumo #18G
Needles 20G X 1 ½” (0.9 X 38 mm Terumo #20G
Needles 21G X 4 ¾” (0.8 X 120 mm B.Braun #466 5643
Parafilm
PBS  Life Technologies  #14190169
Penicillin-Streptomycin  Life Technologies  #15140130
pH-meter
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Sigma  #P7626 PMSF powder is hazardous. Use skin and eye protection when preparing PMSF solutions.
PIPES  Sigma  #P6757
Pipette-boy
Rotors Beckman 70.1 Ti; TLA-100.3; and TLA 55
SDS-PAGE electrophoresis equipment  Bio-Rad  #1658001FC
SDS, Sodium dodecyl sulphate  VWR  #442444H For preparing Laemmeli buffer 
SDS, Sodium dodecyl sulphate  Sigma  #L5750 For preparing 'TUB' SDS-PAGE gels
Sonicator  Branson #101-148-070 Used for lysing cells grown as adherent cultures. Use 6.5 mm diameter probe, set the sonicator at “Output control” 1, “Duty cycle” 10% and time depending on the cell type used.
Tabletop centrifuge for 1.5 ml tubes Eppendorf 5417R 
TEMED, N, N, N′, N′-Tetramethylethylenediamine  Sigma #9281
Trichostatin A (TSA) Sigma #T8552
Triton X-100  Sigma  #T9284
Trizma base (Tris) Sigma  #T1503
Trypsin  Life Technologies #15090046
Ultracentrifuge rotors  TLA-55, TLA-100.3 and 70.1 Ti rotors Set at 4°C or 30°C based on the need of the experiment 
Ultracentrifuge tubes  Beckman #357448  for using with TLA-55 rotor
Ultracentrifuge tubes  Beckman #349622 for using with TLA-100.3 rotor
Ultracentrifuge tubes  Beckman #355631  for using with 70.1 Ti rotor
Ultracentrifuges Beckman Optima L80-XP (or equivalent) and Optima MAX-XP (or equivalent) Set at 4°C or 30°C based on the need of the experiment 
Vortex mixer
Water bath equipped with floaters or tube holders Set at 30°C 

References

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Bodakuntla, S., Jijumon, A., Janke, C., Magiera, M. M. Purification of Tubulin with Controlled Posttranslational Modifications and Isotypes from Limited Sources by Polymerization-Depolymerization Cycles. J. Vis. Exp. (165), e61826, doi:10.3791/61826 (2020).

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