Detta protokoll beskriver tubulin rening från små /medelstora källor såsom odlade celler eller enstaka mus hjärnor, med hjälp av polymerisation och depolymerisering cykler. Det renade tubulinet är berikat i specifika isotyper eller har specifika posttranslational modifieringar och kan användas i in vitro-beredningsanalyser för att studera mikrotubuledynamik och interaktioner.
En viktig aspekt av studier av microtubule cytoskeleton är undersökningen av microtubule beteende i in vitro rekonstitution experiment. De möjliggör analys av de inneboende egenskaperna hos mikrotubuler, såsom dynamik, och deras interaktioner med mikrotubule-associerade proteiner (MAPs). “Tubulinkoden” är ett framväxande koncept som pekar på olika tubulinisottyper och olika posttranslational modifieringar (PTMs) som regulatorer av mikrotubule egenskaper och funktioner. För att utforska de molekylära mekanismerna i tubulinkoden är det viktigt att utföra in vitro-rekonstitutionsexperiment med renad tubulin med specifika isotyper och PTMs.
Hittills var detta tekniskt utmanande som hjärnan tubulin, som används ofta i in vitro experiment, hyser många PTMs och har en definierad isotyp sammansättning. Därför utvecklade vi detta protokoll för att rena tubulin från olika källor och med olika isotypkompositioner och kontrollerade PTMs, med hjälp av den klassiska metoden för polymerisation och depolymerisering cykler. Jämfört med befintliga metoder baserade på affinitet rening, ger detta tillvägagångssätt ren, polymerisation-kompetent tubulin, som tubulin resistent mot polymerisation eller depolymerisering kasseras under de successiva rening steg.
Vi beskriver reningen av tubulin från cellinjer, odlas antingen i suspension eller som vidhäftande kulturer, och från enstaka mus hjärnor. Metoden beskriver först genereringen av cellmassa i både suspension och vidhäftande inställningar, lyssteget, följt av de successiva stadierna av tubulinrening genom polymerisation-depolymeriseringscykler. Vår metod ger tubulin som kan användas i experiment som behandlar effekten av tubulinkoden på de inneboende egenskaperna hos mikrotubuler och mikrotubuleinteraktioner med associerade proteiner.
Mikrotubuler spelar kritiska roller i många cellulära processer. De ger cellerna sin form, bygger meiotiska och mitotiska spindlar för kromosomsegregering och fungerar som spår för intracellulär transport. För att utföra dessa olika funktioner organiserar sig mikrotubuler på olika sätt. En av de spännande frågorna inom området är att förstå de molekylära mekanismer som gör det möjligt för de strukturellt och evolutionärt bevarade mikrotubulerna att anpassa sig till denna mängd organisationer och funktioner. En potentiell mekanism är diversifiering av mikrotubuli, som definieras av begreppet “tubulinkod”1,2,3. Tubulinkoden innehåller två huvudkomponenter: differentiell inkorporering av genprodukterna α- och β-tubulin (tubulinisotyper) i mikrotubuli och tubulin posttranslational modifieringar (PTMs).
Sedan 1970-talet har in vitro-rekonstitutionsexperiment, i kombination med framväxande ljusmikroskopitekniker, banat väg för viktiga upptäckter om egenskaperna hos mikrotubuler: dynamisk instabilitet4 och löpband5, och deras andra mekanismer ochfunktioner 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. Nästan alla in vitro-experiment som utförts hittills har baserats på tubulin renat från hjärnvävnad med upprepade cykler av polymerisation och depolymerisering16,17. Även om rening från hjärnvävnaden ger fördelen av att få högkvalitativ tubulin i stora mängder (vanligtvis gram mängder), är en viktig nackdel heterogeniteten som tubulin renad från hjärnvävnad är en blandning av olika tubulin isotyper och berikas med många tubulin PTMs. Denna heterogenitet gör det omöjligt att avgränsa rollen för en viss tubulin PTM eller isotyp i kontrollen av mikrotubule egenskaper och funktioner. Att producera monteringskompande tubulin med kontrollerade tubulin-PTM:er och homogen isotypsammansättning är därför viktigt för att ta itu med tubulinkodens molekylära mekanismer.
Nyligen har en metod för att rena tubulin genom affinitetskromatografi med hjälp av den mikrotubulebindande TOG-domänen (tumör-överuttryckt gen) av jäst Stu2p utvecklats18. I denna metod passerar tubulin i rålystnater av celler eller vävnad genom en kolumn där den binder till den matris-immobiliserade TOG-domänen, vilket möjliggör analys av hela tubulinpoolen i ett givet, till och med mycket litet, prov. Ett efterlängtat tillvägagångssätt för att rena rekombinant tubulin har också beskrivits under de senaste åren. Det är baserat på baculovirussystemet, där en bi-cistronic vektor som innehåller α- och β-tubulingener uttrycks i insektsceller19. Denna metod är dock mycket besvärlig och tidskrävande och används därför främst för att studera effekten av tubulinmutationer20 och tubulinisotyper21,22,23 in vitro.
I det nuvarande protokollet beskriver vi en metod som använder den väletablerade och allmänt använda polymerisationsdepolymeriseringsmetoden som en plan för att generera tubulin med olika nivåer av modifiering antingen från cellinjer eller från mushjärnvävnad24. I detta förfarande cyklas tubulin mellan lösliga (tubulin dimer vid 4 °C) och polymeriserad form (mikrotubule vid 30 °C i närvaro av guanosin 5′-triphosphate [GTP]). Varje form separeras genom successiva centrifugeringssteg: tubulin dimers kommer att förbli i supernatanten efter en kall (4 °C) spinn, medan mikrotubuler kommer att pelleteras vid 30 °C. Dessutom utförs ett polymerisationssteg vid hög piperazin-N,N′-bis(2-etanesulfonsyra) (PIPES) koncentration, vilket gör det möjligt att avlägsna mikrotubule-associerade proteiner från mikrotubulerna och därmed från det slutligen renade tubulinet. Tubulin renad från HeLa S3-celler som odlas som suspension eller vidhäftande kulturer är praktiskt taget fri från någon tubulin PTM och har använts i de senaste in vitro-rekonstitutionsexperimenten25,26,27,28. Vi har ytterligare anpassat metoden för att rena tubulin från enmushjärnor, som kan användas för ett stort antal musmodeller med förändringar i tubulinisottyper och PTM.
I protokollet beskriver vi först genereringen av källmaterialet (cellmassa eller hjärnvävnad), dess lysis (Figur 1A), följt av successiva steg av tubulinpolymerisering och depolymerisering för att rena tubulinet (Figur 1B). Vi beskriver vidare processen för att bedöma renheten (figur 2A, B) och kvantiteten ( figur3A, B) av det renade tubulinet. Metoden kan anpassas för att producera tubulin berikat med en utvald PTM genom att överuttrycka ett modifierande enzym i celler före tubulinrening (Figur 4B). Alternativt kan tubulinmodifierande enzymer tillsättas till tubulin under reningsprocessen. Slutligen kan vi rena tubulin som saknar specifika isotyper eller PTM från hjärnan hos möss som saknar motsvarande tubulinmodifierande enzymer (Figur 4B)29.
Metoden vi beskriver här har två huvudsakliga fördelar: i) det möjliggör produktion av tillräckligt stora mängder tubulin på relativt kort tid, och (ii) det genererar högkvalitativ, ren tubulin, med antingen specifik tubulin isotypkomposition eller PTMs. I den tillhörande videon av detta manuskript belyser vi några av de kritiska stegen som är involverade i denna procedur.
Metoden som beskrivs här ger en plattform för att snabbt generera högkvalitativ, monterings kompetent tubulin i medelstora stora mängder från cellinjer och enmushjärnor. Det är baserat på guldstandardprotokollet för tubulinrening från nötkreatur hjärnor som används på fältet i många år16,17. En särskild fördel med tillvägagångssättet är användningen av suspensionskulturer av HeLa S3-celler, som när de väl har etablerats ger stora mängde…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av ANR-10-IDEX-0001-02, LabEx Cell’n’Scale ANR-11-LBX-0038 och Institut de convergence Q-life ANR-17-CONV-0005. CJ stöds av Institut Curie, Franska nationella forskningsbyrån (ANR) beviljar ANR-12-BSV2-0007 och ANR-17-CE13-0021, Institut National du Cancer (INCA) bidrag 2014-PL BIO-11-ICR-1 och Fondation pour la Recherche Medicale (FRM) bidrag DEQ20170336756. MMM stöds av Fondation Vaincre Alzheimer grant FR-16055p, och av Frankrike Alzheimer grant AAP SM 2019 n°2023. JAS stöddes av Europeiska unionens forsknings- och innovationsprogram Horizon 2020 inom ramen för Marie Skłodowska-Curie-bidragsavtalet nr 675737 och FRM-bidraget FDT201904008210. SB stöddes av FRM-bidraget FDT201805005465.
Vi tackar alla medlemmar i Janke lab, särskilt J. Souphron, samt G. Lakisic (Institut MICALIS, AgroParisTech) och A. Gautreau (Ecole Polytechnique) för hjälp under upprättandet av protokollet. Vi vill tacka Institut Curies djuranläggning för hjälp med musuppfödning och skötsel.
Antikroppen 12G10, utvecklad av J. Frankel och M. Nelson, erhölls från Developmental Studies Hybridoma Bank utvecklad under beskydd av NICHD och underhållen av University of Iowa.
1 M MgCl2 | Sigma | #M1028 | |
1-L cell culture vessels | Techne F7610 | Used for spinner cultures. Never stir the empty spinner bottles. When spinner bottles are in the cell culture incubator, always keep the lateral valves of spinner bottles slightly open to facilitate the equilibration of media with incubator’s atmosphere. After use, fill the spinner bottles immediately with tap water to avoid drying of remaining cells on the bottle walls. Wash the bottles with deionised water, add app 200 ml of deionised water and autoclave. Under a sterile cell culture hood remove the water and allow the bottles to dry completely, still under the hood, for several hours. Never use detergents for cleaning the spinner bottles because any trace amounts of the detergent can be deleterious to the cells. | |
1.5- and 2-ml tubes | |||
14-ml round-bottom tubes | |||
15-cm-diameter sterile culture dishes | |||
15-ml screw-cap tubes | |||
2-mercaptoethanol | Sigma | #M3148 | 2-mercaptoethanol is toxic and should be used under the hood. |
4-(2-aminoethyl)-benzenesulfonyl fluoride | Sigma | #A8456 | |
40% Acrylamide | Bio-Rad | #161-0140 | |
5-, 10- 20-ml syringes | |||
5-ml, 10-ml, 25-ml sterile pipettes | |||
50-ml screw-cap tubes | |||
Ammonium persulfate (APS) | Sigma | #A3678 | |
Anti-alpha-tubulin antibody, 12G10 | Developed by J. Frankel and M. Nelson, obtained from the Developmental Studies Hybridoma Bank, developed under the auspices of the NICHD, and maintained by the University of Iowa | dilution: 1/500 | |
Anti-glutamylated tubulin antibody, GT335 | AdipoGen | #AG-20B-0020 | dilution: 1/20,000 |
Aprotinin | Sigma | #A1153 | |
Balance (0.1 – 10 g) | |||
Beckman 1-l polypropylene bottles | For collecting spinner cultures | ||
Beckman Avanti J-26 XP centrifuge | For collecting spinner cultures | ||
Biological stirrer | Techne MCS-104L | Installed in the cell culture incubator (for spinner cultures), 25 rpm for Hela S3 and HEK 293 cells | |
Bis N,N’-Methylene-Bis-Acrylamide | Bio-Rad | #161-0201 | |
Blender IKA Ultra-Turrax® | For lysing brain tissue, use 5-mm probe, with the machine set at power 6 or 7. Blend the brain tissue 2-3 times for 15 s on ice. | ||
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | #A7906 | |
Bromophenol blue | Sigma | #1.08122 | |
Carboxypeptidase A (CPA) | Sigma | #C9268 | Concentration: 1.7 U/µl |
Cell culture hood | |||
Cell culture incubator set at 37°C, 5% CO2 | |||
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | #D8418 | DMSO can enhance cell and skin permeability of other compounds. Avoid contact and use skin and eye protection. |
DMEM medium | Life Technologies | #41965062 | |
DTT, DL-Dithiothreitol | Sigma | #D9779 | |
EDTA | Euromedex | #EU0007-C | |
EGTA | Sigma | #E3889 | |
Ethanol absolute | Fisher Chemical | #E/0650DF/15 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | #F7524 | |
French pressure cell press | Thermo electron corporation | #FA-078A | with a #FA-032 cell; for lysing big amounts of cells. Set at medium ratio, and the gauge pressure of 1,000 psi (corresponds to 3,000 psi inside the disruption chamber). |
Glycerol | VWR Chemicals | #24388.295 | |
Glycine | Sigma | #G8898 | |
GTP | Sigma | #G8877 | |
Heating block | Stuart | #SBH130D | |
Hela cells | ATCC® CCL-2™ | ||
Hela S3 cells | ATCC | ATCC® CCL-2.2™ | |
Hydrochloric acid (HCl ) | VWR | #20252.290 | |
Inverted microscope | With fluorescence if cell transfection is to be verified | ||
Isopropanol | VWR | #20842.298 | |
jetPEI | Polyplus | #101 | |
JLA-8.1000 rotor | For collecting spinner cultures | ||
KOH | Sigma | #P1767 | KOH is corrosive and causes burns; use eye and skin protection. |
L-Glutamine | Life Technologies | #25030123 | |
Laboratory centrifuge for 50-ml tubes | Sigma | 4-16 K | |
Leupeptin | Sigma | #L2884 | |
Liquid nitrogen | |||
Micro-pipettes p2.5, p10, p20, p100, p200 and p1000 and corresponding tips | |||
Micropestles | Eppendorf | #0030 120.973 | |
Mouse brain tissue | Animal care and use for this study were performed in accordance with the recommendations of the European Community (2010/63/UE). Experimental procedures were specifically approved by the ethics committee of the Institut Curie CEEA-IC #118 (authorization no. 04395.03 given by National Authority) in compliance with the international guidelines. | ||
Needles 18G X 1 ½” (1.2 X 38 mm | Terumo | #18G | |
Needles 20G X 1 ½” (0.9 X 38 mm | Terumo | #20G | |
Needles 21G X 4 ¾” (0.8 X 120 mm | B.Braun | #466 5643 | |
Parafilm | |||
PBS | Life Technologies | #14190169 | |
Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | #15140130 | |
pH-meter | |||
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | #P7626 | PMSF powder is hazardous. Use skin and eye protection when preparing PMSF solutions. |
PIPES | Sigma | #P6757 | |
Pipette-boy | |||
Rotors | Beckman 70.1 Ti; TLA-100.3; and TLA 55 | ||
SDS-PAGE electrophoresis equipment | Bio-Rad | #1658001FC | |
SDS, Sodium dodecyl sulphate | VWR | #442444H | For preparing Laemmeli buffer |
SDS, Sodium dodecyl sulphate | Sigma | #L5750 | For preparing 'TUB' SDS-PAGE gels |
Sonicator | Branson | #101-148-070 | Used for lysing cells grown as adherent cultures. Use 6.5 mm diameter probe, set the sonicator at “Output control” 1, “Duty cycle” 10% and time depending on the cell type used. |
Tabletop centrifuge for 1.5 ml tubes | Eppendorf | 5417R | |
TEMED, N, N, N′, N′-Tetramethylethylenediamine | Sigma | #9281 | |
Trichostatin A (TSA) | Sigma | #T8552 | |
Triton X-100 | Sigma | #T9284 | |
Trizma base (Tris) | Sigma | #T1503 | |
Trypsin | Life Technologies | #15090046 | |
Ultracentrifuge rotors | TLA-55, TLA-100.3 and 70.1 Ti rotors | Set at 4°C or 30°C based on the need of the experiment | |
Ultracentrifuge tubes | Beckman | #357448 | for using with TLA-55 rotor |
Ultracentrifuge tubes | Beckman | #349622 | for using with TLA-100.3 rotor |
Ultracentrifuge tubes | Beckman | #355631 | for using with 70.1 Ti rotor |
Ultracentrifuges | Beckman | Optima L80-XP (or equivalent) and Optima MAX-XP (or equivalent) | Set at 4°C or 30°C based on the need of the experiment |
Vortex mixer | |||
Water bath equipped with floaters or tube holders | Set at 30°C |