Kvantitativ proteomisk arbeidsflyt ved hjelp av flerreaksjonsovervåkingsbasert påvisning av proteiner fra humant hjernevev
Summary
Protokollen tar sikte på å introdusere bruken av et trippel quadrupole massespektrometer for multippel reaksjonsovervåking (MRM) av proteiner fra kliniske prøver. Vi har levert en systematisk arbeidsflyt som starter fra prøvepreparering til dataanalyse for kliniske prøver med alle nødvendige forholdsregler som skal tas.
Abstract
Den proteomiske analysen av det menneskelige hjernevevet det siste tiåret har i stor grad forbedret vår forståelse av hjernen. Imidlertid fortsetter hjernerelaterte lidelser å være en stor bidragsyter til dødsfall rundt om i verden, noe som nødvendiggjør behovet for enda større forståelse av deres patobiologi. Tradisjonelle antistoffbaserte teknikker som vestlig blotting eller immunhiistokjemi lider av å være lavgjennomstrømning i tillegg til å være arbeidsintensiv og kvalitativ eller semi-kvantitativ. Selv konvensjonelle massespektrometribaserte hagletilnærminger klarer ikke å gi avgjørende bevis for å støtte en viss hypotese. Målrettede proteomikktilnærminger er i stor grad hypotesedrevne og skiller seg fra de konvensjonelle hagleproteomikktilnærmingene som har vært lenge i bruk. Multippel reaksjonsovervåking er en slik målrettet tilnærming som krever bruk av et spesielt massespektrometer kalt tandem quadrupole massespektrometer eller trippel quadrupole massespektrometer. I den nåværende studien har vi systematisk fremhevet de viktigste trinnene som er involvert i å utføre en vellykket tandem quadrupole massespektrometribasert proteomisk arbeidsflyt ved hjelp av menneskelig hjernevev med sikte på å introdusere denne arbeidsflyten til et bredere forskningsmiljø.
Introduction
I løpet av det siste tiåret har den raske utviklingen innen massespektrometri (MS) kombinert med økt forståelse av kromatografiteknikker i stor grad bidratt til å fremme MS-basert proteomikk. Molekylærbiologibaserte teknikker som vestlig blotting og immunhiistokjemi har lenge lidd av reproduserbarhetsproblemer, langsom behandlingstid, variasjon mellom observatører og deres manglende evne til å kvantifisere proteiner nøyaktig, for å nevne noen. For dette formål fortsetter den overlegne følsomheten til proteomikk med høy gjennomstrømning å tilby molekylærbiologer et alternativt og mer pålitelig verktøy i deres søken etter å bedre forstå rollene til proteiner i celler. Imidlertid klarer hagleproteomikk tilnærminger (Dataavhengig oppkjøp eller DDA) ofte ikke å oppdage lave rikelige proteiner i komplekse vev i tillegg til å være sterkt avhengig av instrumentets følsomhet og oppløsning. I løpet av de siste par årene har laboratorier over hele verden utviklet teknikker som Data Independent Acquisition (DIA) som krever økt datakraft og pålitelig programvare som kan håndtere disse svært komplekse datasettene. Imidlertid er disse teknikkene fortsatt et arbeid som pågår og ikke veldig brukervennlig. Målrettede MS-baserte proteomikktilnærminger gir en perfekt balanse mellom ms-tilnærmingenes høye gjennomstrømning og følsomheten til molekylærbiologiske tilnærminger som ELISA. Et målrettet massespektrometribasert proteomikkeksperiment fokuserer på å oppdage hypotesedrevne proteiner eller peptider fra oppdagelsesbaserte hagleproteomikkeksperimenter eller gjennom tilgjengelig litteratur1,2. Multiple Reaction Monitoring (MRM) er en slik målrettet MS-tilnærming som bruker et tandem quadrupole massespektrometer for nøyaktig deteksjon og kvantifisering av proteiner / peptider fra komplekse prøver. Teknikken gir høyere følsomhet og spesifisitet til tross for at det kreves bruk av et instrument med lav oppløsning.
En quadrupole er laget av 4 parallelle stenger, med hver stang koblet til den diagonalt motsatte stangen. Et varierende felt opprettes mellom quadrupole stengene ved å bruke vekslende RF- og DC-spenninger. Banen til ionene inne i quadrupole påvirkes av tilstedeværelsen av de samme spenningene over motsatte stenger. Ved å bruke RF på DC-spenning, kan banen til ionene stabiliseres. Det er denne egenskapen til quadrupole som gjør at den kan brukes som et massefilter som selektivt kan la spesifikke ioner passere gjennom. Avhengig av behovet kan en quadrupole betjenes enten i statisk modus eller skannemodus. Den statiske modusen tillater bare ioner med en spesifisert m / z å passere gjennom, noe som gjør modusen svært selektiv og spesifikk for ion av interesse. Skannemodusen derimot gjør at ioner over hele m / z-området kan passere gjennom. Dermed kan tandem quadrupole massespektrometre fungere på 4 mulige måter: i) den første quadrupole som opererer i statisk modus mens den andre opererer i skannemodus; ii) den første quadrupole som opererer i skannemodus mens den andre opererer i statisk modus; iii) begge quadrupoles som opererer i skannemodus; og iv) begge quadrupoles som opererer i statisk modus3. I et typisk MRM-eksperiment opererer begge quadrupoles i statisk modus, slik at spesifikke forløpere og deres resulterende produkter etter fragmentering kan overvåkes. Dette gjør teknikken svært følsom og selektiv, noe som gir nøyaktig kvantifisering.
For molekylærbiologer er det menneskelige hjernevevet og dets celler en skattekiste. Disse bemerkelsesverdige enhetene i et stadig interessant organ i menneskekroppen kan gi molekylær og cellulær innsikt i dens funksjon. Proteomiske undersøkelser av hjernevevet kan ikke bare hjelpe oss med å forstå den systemiske funksjonen til en sunn hjerne, men også de cellulære veiene som blir dysregulert når de påføres av en eller annen sykdom4. Imidlertid er hjernevevet med all sin heterogenitet et svært komplekst organ å analysere og krever en samordnet tilnærming for en bedre forståelse av endringene på molekylært nivå. Følgende arbeid beskriver hele arbeidsflyten som starter helt fra å trekke ut proteiner fra hjernevev, skape og optimalisere metodene for MRM-analyse, til validering av målene (Figur 1). Her har vi systematisk fremhevet de viktigste trinnene som er involvert i et vellykket MRM-basert eksperiment ved hjelp av menneskelig hjernevev med sikte på å introdusere teknikken og dens utfordringer for et bredere forskningsmiljø.
Protocol
Representative Results
Discussion
Teknikker som immunhiistokjemi og vestlig blotting ble ansett som gullstandardene for validering av proteinmål i mange år. Disse metodene finner bruk selv i dag med mindre modifikasjoner i protokollen og liten avhengighet av teknologi som gjør dem svært tungvinte og kjedelige. Foruten dette innebærer de også bruk av dyre antistoffer som ikke alltid viser samme spesifisitet på tvers av partier og krever mye kompetanse. I tillegg har bare en liten brøkdel av proteiner identifisert ved hjelp av høy gjennomstrømni…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi anerkjenner MHRD-UAY Project (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), prosjekt #34_IITB til SS og MASSFIITB Facility ved IIT Bombay støttet av Institutt for bioteknologi (BT/PR13114/INF/22/206/2015) for å utføre alle MS-relaterte eksperimenter.
Vi utvider vår spesielle takk til Mr. Rishabh Yadav for å lage og redigere hele videoen og Mr. Nishant Nerurkar for hans arbeid med å redigere lyden.
Materials
| Reagents | |||
| Acetonitrile (MS grade) | Fisher Scientific | A/0620/21 | |
| Bovine Serum Albumin | HiMedia | TC194-25G | |
| Calcium chloride | Fischer Scienific | BP510-500 | |
| Formic acid (MS grade) | Fisher Scientific | 147930250 | |
| Iodoacetamide | Sigma | 1149-25G | |
| Isopropanol (MS grade) | Fisher Scientific | Q13827 | |
| Magnesium Chloride | Fischer Scienific | BP214-500 | |
| Methanol (MS grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| MS grade water | Pierce | 51140 | |
| Phosphate Buffer Saline | HiMedia | TL1006-500ML | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Sodium Chloride | Merck | DF6D661300 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Tris Base | Merck | 648310 | |
| Trypsin (MS grade) | Pierce | 90058 | |
| Urea | Merck | MB1D691237 | |
| Supplies | |||
| Hypersil Gold C18 column | Thermo | 25002-102130 | |
| Micropipettes | Gilson | F167380 | |
| Stage tips | MilliPore | ZTC18M008 | |
| Zirconia/Silica beads | BioSpec products | 11079110z | |
| Equipment | |||
| Bead beater (Homogeniser) | Bertin Minilys | P000673-MLYS0-A | |
| Microplate reader (spectrophotometer) | Thermo | MultiSkan Go | |
| pH meter | Eutech | CyberScan pH 510 | |
| Probe Sonicator | Sonics Materials, Inc | VCX 130 | |
| Shaking Drybath | Thermo | 88880028 | |
| TSQ Altis mass spectrometer | Thermo | TSQ02-10002 | |
| uHPLC – Vanquish | Thermo | VQF01-20001 | |
| Vacuum concentrator | Thermo | Savant ISS 110 |
References
- Picotti, P., Aebersold, R. Selected reaction monitoring-based proteomics: Workflows, potential, pitfalls and future directions. Nature Methods. , (2012).
- Carr, S. A., et al. Targeted peptide measurements in biology and medicine: Best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach. Molecular and Cellular Proteomics. 13 (3), 907-917 (2014).
- Pitt, J. J. Principles and applications of liquid chromatography-mass spectrometry in clinical biochemistry. The Clinical biochemist Reviews. 30 (1), 19-34 (2009).
- Hosp, F., Mann, M. A Primer on Concepts and Applications of Proteomics in Neuroscience. Neuron. 96 (3), 558-571 (2017).
- Scopes, R. K. Measurement of protein by spectrophotometry at 205 nm. Analytical Biochemistry. , (1974).
- Kusebauch, U., et al. Human SRMAtlas: A Resource of Targeted Assays to Quantify the Complete Human Proteome. Cell. , (2016).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
- Gerber, S. A., Rush, J., Stemman, O., Kirschner, M. W., Gygi, S. P. Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2003).
- Escher, C., et al. Using iRT, a normalized retention time for more targeted measurement of peptides. Proteomics. , (2012).
- Gillette, M. A., Carr, S. A. Quantitative analysis of peptides and proteins in biomedicine by targeted mass spectrometry. Nature Methods. 10 (1), 28-34 (2013).
- Whiteaker, J. R., et al. A targeted proteomics-based pipeline for verification of biomarkers in plasma. Nature Biotechnology. , (2011).
- Hüttenhain, R., et al. Reproducible quantification of cancer-associated proteins in body fluids using targeted proteomics. Science Translational Medicine. 4 (142), 94 (2012).
- Mermelekas, G., Vlahou, A., Zoidakis, J. SRM/MRM targeted proteomics as a tool for biomarker validation and absolute quantification in human urine. Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (11), 1441-1454 (2015).
- Koldamova, R. P., Lefterov, I. M., Lefterova, M. I., Lazo, J. S. Apolipoprotein A-I directly interacts with amyloid precursor protein and inhibits Aβ aggregation and toxicity. 생화학. , (2001).
- Jiang, S. X., Slinn, J., Aylsworth, A., Hou, S. T. Vimentin participates in microglia activation and neurotoxicity in cerebral ischemia. Journal of Neurochemistry. , (2012).
- Liu, L. Y., et al. Nicotinamide Phosphoribosyltransferase May Be Involved in Age-Related Brain Diseases. PLoS ONE. , (2012).
- Abbatiello, S., et al. New guidelines for publication of manuscripts describing development and application of targeted mass spectrometry measurements of peptides and proteins. Molecular and Cellular Proteomics. 16 (3), 327-328 (2017).
