Flusso di lavoro di proteomica quantitativa utilizzando il rilevamento basato sul monitoraggio di reazioni multiple di proteine dal tessuto cerebrale umano
Summary
Il protocollo mira a introdurre l’uso di uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo per il monitoraggio a reazione multipla (MRM) di proteine provenienti da campioni clinici. Abbiamo fornito un flusso di lavoro sistematico a partire dalla preparazione dei campioni all’analisi dei dati per i campioni clinici con tutte le precauzioni necessarie da prendere.
Abstract
L’analisi proteomica del tessuto cerebrale umano nell’ultimo decennio ha notevolmente migliorato la nostra comprensione del cervello. Tuttavia, i disturbi legati al cervello continuano ad essere uno dei principali contributori di decessi in tutto il mondo, rendendo necessaria una comprensione ancora maggiore della loro patobiologia. Le tecniche tradizionali basate su anticorpi come il western blotting o l’immunoistochimica soffrono di bassa produttività oltre ad essere laboriose e qualitative o semi-quantitative. Anche gli approcci convenzionali basati sulla spettrometria di massa non riescono a fornire prove conclusive a sostegno di una certa ipotesi. Gli approcci proteomici mirati sono in gran parte guidati da ipotesi e differiscono dagli approcci convenzionali di proteomica del fucile da caccia che sono stati a lungo in uso. Il monitoraggio a reazione multipla è uno di questi approcci mirati che richiede l’uso di uno speciale spettrometro di massa chiamato spettrometro di massa a quadrupolo tandem o spettrometro di massa a triplo quadrupolo. Nel presente studio, abbiamo sistematicamente evidenziato i principali passi coinvolti nell’esecuzione di un flusso di lavoro proteomico basato sulla spettrometria di massa a quadrupolo tandem di successo utilizzando il tessuto cerebrale umano con l’obiettivo di introdurre questo flusso di lavoro a una più ampia comunità di ricerca.
Introduction
Durante l’ultimo decennio, i rapidi sviluppi della spettrometria di massa (SM) insieme a una maggiore comprensione delle tecniche di cromatografia hanno notevolmente aiutato nel progresso della proteomica basata sulla SM. Le tecniche basate sulla biologia molecolare come il western blotting e l’immunoistochimica hanno sofferto a lungo di problemi di riproducibilità, tempi di consegna lenti, variabilità inter-osservatore e la loro incapacità di quantificare accuratamente le proteine, per citarne alcuni. A tal fine, la sensibilità superiore degli approcci proteomici ad alto rendimento continua a offrire ai biologi molecolari uno strumento alternativo e più affidabile nella loro ricerca per comprendere meglio il ruolo delle proteine nelle cellule. Tuttavia, gli approcci di proteomica shotgun (Data dependent Acquisition o DDA) spesso non riescono a rilevare proteine a bassa abbondanza nei tessuti complessi oltre ad essere fortemente dipendenti dalla sensibilità e dalla risoluzione dello strumento. Negli ultimi due anni, i laboratori di tutto il mondo hanno sviluppato tecniche come Data Independent Acquisition (DIA) che richiedono una maggiore potenza di calcolo e un software affidabile in grado di gestire questi set di dati altamente complessi. Tuttavia, queste tecniche sono ancora un work in progress e non molto user friendly. Gli approcci proteomici mirati basati sulla SM forniscono un perfetto equilibrio tra la natura ad alto rendimento degli approcci SM e la sensibilità degli approcci di biologia molecolare come ELISA. Un esperimento mirato di proteomica basato sulla spettrometria di massa si concentra sulla rilevazione di proteine o peptidi guidati da ipotesi da esperimenti di proteomica basati sulla scoperta o attraverso la letteratura disponibile1,2. Il monitoraggio a reazione multipla (MRM) è uno di questi approcci mirati alla SM che utilizza uno spettrometro di massa a quadrupolo tandem per il rilevamento e la quantificazione accurati di proteine / peptidi da campioni complessi. La tecnica offre maggiore sensibilità e specificità nonostante richieda l’uso di uno strumento a bassa risoluzione.
Un quadrupolo è costituito da 4 aste parallele, con ogni asta collegata all’asta diagonalmente opposta. Un campo fluttuante viene creato tra le aste quadrupolo applicando tensioni RF e DC alternate. La traiettoria degli ioni all’interno del quadrupolo è influenzata dalla presenza delle stesse tensioni attraverso barre opposte. Applicando la tensione RF a CC, la traiettoria degli ioni può essere stabilizzata. È questa proprietà del quadrupolo che gli consente di essere utilizzato come filtro di massa in grado di far passare selettivamente ioni specifici. A seconda delle esigenze, un quadrupolo può essere azionato sia in modalità statica che in modalità di scansione. La modalità statica consente il passaggio solo di ioni con un m/z specificato, rendendo la modalità altamente selettiva e specifica per lo ione di interesse. La modalità di scansione, d’altra parte, consente il passaggio di ioni su tutta la gamma m / z. Pertanto, gli spettrometri di massa a quadrupolo tandem possono funzionare in 4 modi possibili: i) il primo quadrupolo che opera in modalità statica mentre il secondo opera in modalità di scansione; ii) il primo quadrupolo operante in modalità di scansione mentre il secondo operante in modalità statica; iii) entrambe le quadruffle che operano in modalità di scansione; e iv) entrambi i quadrupoli operanti in modalità statica3. In un tipico esperimento MRM, entrambi i quadruttori operano in modalità statica consentendo di monitorare specifici precursori e i loro prodotti risultanti dopo la frammentazione. Questo rende la tecnica molto sensibile e selettiva permettendo una quantificazione accurata.
Per i biologi molecolari, il tessuto cerebrale umano e le sue cellule sono un tesoro. Queste notevoli unità di un organo sempre interessante del corpo umano possono fornire informazioni molecolari e cellulari sul suo funzionamento. Le indagini proteomiche del tessuto cerebrale possono non solo aiutarci a capire il funzionamento sistemico di un cervello sano, ma anche i percorsi cellulari che si disregolano quando inflitti da qualche malattia4. Tuttavia, il tessuto cerebrale con tutta la sua eterogeneità è un organo molto complesso da analizzare e richiede un approccio concertato per una migliore comprensione dei cambiamenti a livello molecolare. Il lavoro che segue descrive l’intero flusso di lavoro a partire dall’estrazione di proteine dal tessuto cerebrale, creando e ottimizzando i metodi per il test MRM, fino alla convalida dei bersagli (Figura 1). Qui, abbiamo sistematicamente evidenziato i principali passi coinvolti in un esperimento basato sulla MRM di successo che utilizza tessuto cerebrale umano con l’obiettivo di introdurre la tecnica e le sue sfide a una comunità di ricerca più ampia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tecniche come l’immunoistochimica e il Western blotting sono state considerate come i gold standard per la convalida di bersagli proteici per molti anni. Questi metodi trovano uso ancora oggi con piccole modifiche nel protocollo e poca dipendenza dalla tecnologia che li rende molto ingombranti e noiosi. Oltre a questo, comportano anche l’uso di anticorpi costosi che non sempre mostrano la stessa specificità tra i lotti e richiedono una grande quantità di esperienza. Inoltre, solo una piccola frazione di proteine ident…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Riconosciamo mhrd-UAY Project (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), progetto #34_IITB a SS e MASSFIITB Facility presso IIT Bombay supportato dal Dipartimento di Biotecnologie (BT / PR13114 / INF / 22/206/ 2015) per effettuare tutti gli esperimenti relativi alla SM.
Estendiamo i nostri ringraziamenti speciali al signor Rishabh Yadav per la realizzazione e il montaggio dell’intero video e al signor Nishant Nerurkar per il suo lavoro nel montaggio dell’audio.
Materials
| Reagents | |||
| Acetonitrile (MS grade) | Fisher Scientific | A/0620/21 | |
| Bovine Serum Albumin | HiMedia | TC194-25G | |
| Calcium chloride | Fischer Scienific | BP510-500 | |
| Formic acid (MS grade) | Fisher Scientific | 147930250 | |
| Iodoacetamide | Sigma | 1149-25G | |
| Isopropanol (MS grade) | Fisher Scientific | Q13827 | |
| Magnesium Chloride | Fischer Scienific | BP214-500 | |
| Methanol (MS grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| MS grade water | Pierce | 51140 | |
| Phosphate Buffer Saline | HiMedia | TL1006-500ML | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Sodium Chloride | Merck | DF6D661300 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Tris Base | Merck | 648310 | |
| Trypsin (MS grade) | Pierce | 90058 | |
| Urea | Merck | MB1D691237 | |
| Supplies | |||
| Hypersil Gold C18 column | Thermo | 25002-102130 | |
| Micropipettes | Gilson | F167380 | |
| Stage tips | MilliPore | ZTC18M008 | |
| Zirconia/Silica beads | BioSpec products | 11079110z | |
| Equipment | |||
| Bead beater (Homogeniser) | Bertin Minilys | P000673-MLYS0-A | |
| Microplate reader (spectrophotometer) | Thermo | MultiSkan Go | |
| pH meter | Eutech | CyberScan pH 510 | |
| Probe Sonicator | Sonics Materials, Inc | VCX 130 | |
| Shaking Drybath | Thermo | 88880028 | |
| TSQ Altis mass spectrometer | Thermo | TSQ02-10002 | |
| uHPLC – Vanquish | Thermo | VQF01-20001 | |
| Vacuum concentrator | Thermo | Savant ISS 110 |
References
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