Flujo de trabajo de proteómica cuantitativa utilizando la detección basada en el monitoreo de reacciones múltiples de proteínas del tejido cerebral humano
Summary
El protocolo tiene como objetivo introducir el uso de un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo para el monitoreo de reacción múltiple (MRM) de proteínas de muestras clínicas. Hemos proporcionado un flujo de trabajo sistemático desde la preparación de muestras hasta el análisis de datos para muestras clínicas con todas las precauciones necesarias a tomar.
Abstract
El análisis proteómico del tejido cerebral humano durante la última década ha mejorado en gran medida nuestra comprensión del cerebro. Sin embargo, los trastornos relacionados con el cerebro siguen siendo un importante contribuyente de muertes en todo el mundo, lo que requiere la necesidad de una comprensión aún mayor de su patobiología. Las técnicas tradicionales basadas en anticuerpos como el western blotting o la inmunohistoquímica sufren de bajo rendimiento, además de ser intensivas en mano de obra y cualitativas o semicuantitativas. Incluso los enfoques convencionales de escopeta basados en espectrometría de masas no proporcionan evidencia concluyente para apoyar una determinada hipótesis. Los enfoques de proteómica dirigida se basan en gran medida en hipótesis y difieren de los enfoques de proteómica de escopeta convencionales que se han utilizado durante mucho tiempo. El monitoreo de reacciones múltiples es uno de esos enfoques específicos que requiere el uso de un espectrómetro de masas especial llamado espectrómetro de masas cuadrupolo en tándem o espectrómetro de masas cuadrupolo triple. En el estudio actual, hemos destacado sistemáticamente los principales pasos involucrados en la realización de un flujo de trabajo exitoso de proteómica basada en espectrometría de masas cuadrupolo en tándem utilizando tejido cerebral humano con el objetivo de introducir este flujo de trabajo a una comunidad de investigación más amplia.
Introduction
Durante la última década, los rápidos desarrollos en espectrometría de masas (EM) junto con una mayor comprensión de las técnicas de cromatografía han ayudado en gran medida en el avance de la proteómica basada en la EM. Las técnicas basadas en la biología molecular, como el western blotting y la inmunohistoquímica, han sufrido durante mucho tiempo problemas de reproducibilidad, tiempo de respuesta lento, variabilidad entre observadores y su incapacidad para cuantificar con precisión las proteínas, por nombrar algunos. Con este fin, la sensibilidad superior de los enfoques de proteómica de alto rendimiento continúa ofreciendo a los biólogos moleculares una herramienta alternativa y más confiable en su búsqueda para comprender mejor el papel de las proteínas en las células. Sin embargo, los enfoques de proteómica de escopeta (adquisición dependiente de datos o DDA) a menudo no detectan proteínas poco abundantes en tejidos complejos, además de depender en gran medida de la sensibilidad y la resolución del instrumento. En los últimos años, los laboratorios de todo el mundo han estado desarrollando técnicas como la adquisición independiente de datos (DIA) que requieren una mayor potencia informática y un software confiable que pueda manejar estos conjuntos de datos altamente complejos. Sin embargo, estas técnicas siguen siendo un trabajo en progreso y no son muy fáciles de usar. Los enfoques proteómicos específicos basados en la EM proporcionan un equilibrio perfecto entre la naturaleza de alto rendimiento de los enfoques de EM y la sensibilidad de los enfoques de biología molecular como ELISA. Un experimento de proteómica basado en espectrometría de masas dirigida se centra en la detección de proteínas o péptidos impulsados por hipótesis a partir de experimentos de proteómica de escopeta basados en descubrimientos o a través de la literatura disponible1,2. El monitoreo de reacción múltiple (MRM) es uno de esos enfoques específicos de EM que utiliza un espectrómetro de masas cuadrupolo en tándem para la detección y cuantificación precisas de proteínas / péptidos de muestras complejas. La técnica ofrece una mayor sensibilidad y especificidad a pesar de requerir el uso de un instrumento de baja resolución.
Un cuadrupolo está hecho de 4 varillas paralelas, con cada varilla conectada a la varilla diagonalmente opuesta. Se crea un campo fluctuante entre las varillas cuadrupolares aplicando voltajes alternos de RF y CC. La trayectoria de los iones dentro del cuadrupolo está influenciada por la presencia de los mismos voltajes a través de varillas opuestas. Al aplicar el voltaje de RF a CC, se puede estabilizar la trayectoria de los iones. Es esta propiedad del cuadrupolo la que le permite ser utilizado como un filtro de masa que puede dejar pasar selectivamente iones específicos. Dependiendo de la necesidad, un cuadrupolo se puede operar en el modo estático o en el modo de escaneo. El modo estático permite que solo pasen iones con un m / z especificado, lo que hace que el modo sea altamente selectivo y específico para el ion de interés. El modo de escaneo, por otro lado, permite que pasen iones en todo el rango m / z. Por lo tanto, los espectrómetros de masas cuadrupolo en tándem pueden operar de 4 maneras posibles: i) el primer cuadrupolo que opera en modo estático mientras que el segundo opera en modo de escaneo; ii) el primer cuadrupolo que funciona en el modo de escaneo mientras que el segundo funciona en el modo estático; iii) ambos cuadrupolos que operan en el modo de escaneo; y iv) ambos cuadrupolos que funcionan en modo estático3. En un experimento típico de MRM, ambos cuadrupolos operan en modo estático, lo que permite monitorear precursores específicos y sus productos resultantes después de la fragmentación. Esto hace que la técnica sea muy sensible y selectiva, lo que permite una cuantificación precisa.
Para los biólogos moleculares, el tejido cerebral humano y sus células son un tesoro. Estas notables unidades de un órgano siempre interesante del cuerpo humano pueden proporcionar información molecular y celular sobre su funcionamiento. Las investigaciones proteómicas del tejido cerebral no solo pueden ayudarnos a comprender el funcionamiento sistémico de un cerebro sano, sino también las vías celulares que se desregulan cuando son infligidas por alguna enfermedad4. Sin embargo, el tejido cerebral con toda su heterogeneidad es un órgano muy complejo de analizar y requiere un enfoque concertado para una mejor comprensión de los cambios a nivel molecular. El siguiente trabajo describe todo el flujo de trabajo desde la extracción de proteínas del tejido cerebral, la creación y optimización de los métodos para el ensayo mrm, hasta la validación de los objetivos(Figura 1). Aquí, hemos destacado sistemáticamente los principales pasos involucrados en un experimento exitoso basado en MRM utilizando tejido cerebral humano con el objetivo de introducir la técnica y sus desafíos a una comunidad de investigación más amplia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Técnicas como la inmunohistoquímica y el Western blotting fueron consideradas como los estándares de oro para la validación de objetivos de proteínas durante muchos años. Estos métodos encuentran uso incluso hoy en día con pequeñas modificaciones en el protocolo y poca dependencia de la tecnología, lo que los hace muy engorrosos y tediosos. Además de esto, también implican el uso de anticuerpos costosos que no siempre muestran la misma especificidad en todos los lotes y requieren una gran cantidad de experie…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconocemos el Proyecto MHRD-UAY (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), proyecto #34_IITB a las instalaciones de SS y MASSFIITB en IIT Bombay con el apoyo del Departamento de Biotecnología (BT/PR13114/INF/22/206/2015) para llevar a cabo todos los experimentos relacionados con la EM.
Extendemos nuestro agradecimiento especial al Sr. Rishabh Yadav por hacer y editar todo el video y al Sr. Nishant Nerurkar por su trabajo en la edición del audio.
Materials
| Reagents | |||
| Acetonitrile (MS grade) | Fisher Scientific | A/0620/21 | |
| Bovine Serum Albumin | HiMedia | TC194-25G | |
| Calcium chloride | Fischer Scienific | BP510-500 | |
| Formic acid (MS grade) | Fisher Scientific | 147930250 | |
| Iodoacetamide | Sigma | 1149-25G | |
| Isopropanol (MS grade) | Fisher Scientific | Q13827 | |
| Magnesium Chloride | Fischer Scienific | BP214-500 | |
| Methanol (MS grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| MS grade water | Pierce | 51140 | |
| Phosphate Buffer Saline | HiMedia | TL1006-500ML | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Sodium Chloride | Merck | DF6D661300 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Tris Base | Merck | 648310 | |
| Trypsin (MS grade) | Pierce | 90058 | |
| Urea | Merck | MB1D691237 | |
| Supplies | |||
| Hypersil Gold C18 column | Thermo | 25002-102130 | |
| Micropipettes | Gilson | F167380 | |
| Stage tips | MilliPore | ZTC18M008 | |
| Zirconia/Silica beads | BioSpec products | 11079110z | |
| Equipment | |||
| Bead beater (Homogeniser) | Bertin Minilys | P000673-MLYS0-A | |
| Microplate reader (spectrophotometer) | Thermo | MultiSkan Go | |
| pH meter | Eutech | CyberScan pH 510 | |
| Probe Sonicator | Sonics Materials, Inc | VCX 130 | |
| Shaking Drybath | Thermo | 88880028 | |
| TSQ Altis mass spectrometer | Thermo | TSQ02-10002 | |
| uHPLC – Vanquish | Thermo | VQF01-20001 | |
| Vacuum concentrator | Thermo | Savant ISS 110 |
References
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