Fluxo de trabalho de proteômica quantitativa usando detecção baseada em monitoramento de múltiplas reações de proteínas do tecido cerebral humano
Summary
O protocolo visa introduzir o uso de um espectrômetro de massa quadrupole triplo para monitoramento de reação múltipla (MRM) de proteínas de amostras clínicas. Fornecemos um fluxo de trabalho sistemático desde a preparação da amostra até a análise de dados para amostras clínicas com todas as precauções necessárias a serem tomadas.
Abstract
A análise proteômica do tecido cerebral humano na última década aumentou muito nossa compreensão do cérebro. No entanto, os distúrbios cerebrais continuam a ser um dos principais contribuintes das mortes em todo o mundo, necessitando da necessidade de uma compreensão ainda maior de sua patobiologia. Técnicas tradicionais baseadas em anticorpos, como a mancha ocidental ou a imunohistoquímica sofrem de baixa produtividade, além de serem intensivas em mão-de-obra e qualitativas ou semi-quantitativas. Mesmo abordagens convencionais baseadas em espectrometria de massa não fornecem evidências conclusivas para apoiar uma determinada hipótese. As abordagens proteômicas direcionadas são em grande parte orientadas por hipóteses e diferem das abordagens convencionais de proteômica da espingarda que têm sido há muito tempo em uso. O monitoramento de reação múltipla é uma dessas abordagens direcionadas que requer o uso de um espectrômetro de massa especial chamado espectrômetro de massa quadrupole tandem ou espectrômetro de massa quadrupole triplo. No presente estudo, temos destacado sistematicamente os principais passos envolvidos na realização de um fluxo de trabalho de protetrometria de massa baseado em espectrometria de massa tandem bem sucedido usando tecido cerebral humano com o objetivo de introduzir esse fluxo de trabalho a uma comunidade de pesquisa mais ampla.
Introduction
Durante a última década, os rápidos desenvolvimentos da espectrometria de massa (MS) juntamente com o aumento da compreensão das técnicas de cromatografia ajudaram muito no avanço da proteômica baseada em MS. Técnicas baseadas em biologia molecular, como a mancha ocidental e a imunohistoquímica, há muito sofrem com problemas de reprodutibilidade, tempo de reviravolta lento, variabilidade entre observadores e sua incapacidade de quantificar com precisão proteínas, para citar alguns. Para isso, a sensibilidade superior das abordagens proteômicas de alto rendimento continua a oferecer aos biólogos moleculares uma ferramenta alternativa e mais confiável em sua busca para entender melhor os papéis das proteínas nas células. No entanto, as abordagens de proteômica de espingarda (Aquisição dependente de dados ou DDA) muitas vezes não conseguem detectar proteínas de baixa abundância em tecidos complexos, além de serem fortemente dependentes da sensibilidade e resolução do instrumento. Nos últimos dois anos, laboratórios em todo o mundo vêm desenvolvendo técnicas como o Data Independent Acquisition (DIA) que exigem maior poder computacional e software confiável que pode lidar com esses conjuntos de dados altamente complexos. No entanto, essas técnicas ainda são um trabalho em andamento e não muito fáceis de usar. Abordagens de proteômica baseadas em MS fornecem um equilíbrio perfeito entre a natureza de alto rendimento das abordagens de ESM e a sensibilidade de abordagens de biologia molecular como a ELISA. Um experimento de proteômica baseado em espectrometria de massa focado na detecção de proteínas ou peptídeos baseados em hipóteses a partir de experimentos de proteômica de espingarda baseada em descobertas ou através da literatura disponível1,2. O Monitor de Reação Múltipla (MRM) é uma abordagem de MS direcionada que usa um espectrômetro de massa quadrupole tandem para detecção precisa e quantificação de proteínas/peptídeos a partir de amostras complexas. A técnica oferece maior sensibilidade e especificidade, apesar de exigir o uso de um instrumento de baixa resolução.
Um quadrupole é feito de 4 hastes paralelas, com cada haste conectada à haste diagonalmente oposta. Um campo flutuante é criado entre as hastes quadrupoles aplicando tensões de RF e DC alternadas. A trajetória dos íons dentro do quadrupole é influenciada pela presença das mesmas tensões através de hastes opostas. Aplicando o RF à tensão DC, a trajetória dos íons pode ser estabilizada. É esta propriedade do quadrupole que permite que ele seja usado como um filtro de massa que pode seletivamente deixar íons específicos passarem. Dependendo da necessidade, um quadrúpole pode ser operado no modo estático ou no modo de digitalização. O modo estático permite que apenas íons com um m/z especificado passem, tornando o modo altamente seletivo e específico para o íon de interesse. O modo de digitalização, por outro lado, permite que íons em toda a faixa m/z passem. Assim, os espectrômetros de massa de quadrupole tandem podem operar de 4 maneiras possíveis: i) o primeiro quadrupole operando no modo estático enquanto o segundo operando no modo de digitalização; ii) o primeiro quadrúpole operando no modo de digitalização enquanto o segundo opera no modo estático; iii) ambos os quadrupoles que operam no modo de digitalização; iv) ambos quadrupoles operando no modo estático3. Em um experimento típico de MRM, ambos os quadrupoles operam no modo estático permitindo que precursores específicos e seus produtos resultantes após a fragmentação sejam monitorados. Isso torna a técnica muito sensível e seletiva permitindo quantificação precisa.
Para biólogos moleculares, o tecido cerebral humano e suas células são um tesouro. Essas unidades notáveis de um órgão sempre interessante do corpo humano podem fornecer insights moleculares e celulares sobre seu funcionamento. Investigações proteômicas do tecido cerebral podem não apenas nos ajudar a entender o funcionamento sistêmico de um cérebro saudável, mas também as vias celulares que são desreguladas quando infligidas por alguma doença4. No entanto, o tecido cerebral com toda a sua heterogeneidade é um órgão muito complexo para analisar e requer uma abordagem concertada para uma melhor compreensão das mudanças no nível molecular. O trabalho a seguir descreve todo o fluxo de trabalho começando desde a extração de proteínas do tecido cerebral, criando e otimizando os métodos para ensaios de MRM, até a validação dos alvos(Figura 1). Aqui, temos destacado sistematicamente os principais passos envolvidos em um experimento bem-sucedido baseado em MRM usando tecido cerebral humano com o objetivo de introduzir a técnica e seus desafios para uma comunidade de pesquisa mais ampla.
Protocol
Representative Results
Discussion
Técnicas como a imunohistoquímica e a mancha ocidental foram consideradas como os padrões de ouro para validação de alvos proteicos por muitos anos. Esses métodos encontram uso ainda hoje com pequenas modificações no protocolo e pouca dependência da tecnologia tornando-os muito complicados e tediosos. Além disso, envolvem também o uso de anticorpos caros que nem sempre mostram a mesma especificidade entre os lotes e exigem muita expertise. Além disso, apenas uma pequena fração de proteínas identificadas u…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconhecemos o Projeto MHRD-UAY (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), projeto #34_IITB ao SS e ao MASSFIITB Facility na IIT Bombay apoiado pelo Departamento de Biotecnologia (BT/PR13114/INF/22/206/2015) para realizar todos os experimentos relacionados ao MS.
Estendemos nossos agradecimentos especiais ao Sr. Rishabh Yadav por fazer e editar todo o vídeo e o Sr. Nishant Nerurkar por seu trabalho na edição do áudio.
Materials
| Reagents | |||
| Acetonitrile (MS grade) | Fisher Scientific | A/0620/21 | |
| Bovine Serum Albumin | HiMedia | TC194-25G | |
| Calcium chloride | Fischer Scienific | BP510-500 | |
| Formic acid (MS grade) | Fisher Scientific | 147930250 | |
| Iodoacetamide | Sigma | 1149-25G | |
| Isopropanol (MS grade) | Fisher Scientific | Q13827 | |
| Magnesium Chloride | Fischer Scienific | BP214-500 | |
| Methanol (MS grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| MS grade water | Pierce | 51140 | |
| Phosphate Buffer Saline | HiMedia | TL1006-500ML | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Sodium Chloride | Merck | DF6D661300 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Tris Base | Merck | 648310 | |
| Trypsin (MS grade) | Pierce | 90058 | |
| Urea | Merck | MB1D691237 | |
| Supplies | |||
| Hypersil Gold C18 column | Thermo | 25002-102130 | |
| Micropipettes | Gilson | F167380 | |
| Stage tips | MilliPore | ZTC18M008 | |
| Zirconia/Silica beads | BioSpec products | 11079110z | |
| Equipment | |||
| Bead beater (Homogeniser) | Bertin Minilys | P000673-MLYS0-A | |
| Microplate reader (spectrophotometer) | Thermo | MultiSkan Go | |
| pH meter | Eutech | CyberScan pH 510 | |
| Probe Sonicator | Sonics Materials, Inc | VCX 130 | |
| Shaking Drybath | Thermo | 88880028 | |
| TSQ Altis mass spectrometer | Thermo | TSQ02-10002 | |
| uHPLC – Vanquish | Thermo | VQF01-20001 | |
| Vacuum concentrator | Thermo | Savant ISS 110 |
References
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