זרימת עבודה של פרוטאומיה כמותית באמצעות זיהוי מבוסס ניטור תגובה מרובה של חלבונים מרקמת המוח האנושית
Summary
הפרוטוקול נועד להציג את השימוש בספקטרומטר מסה מרובע משולש לניטור תגובה מרובה (MRM) של חלבונים מדגימות קליניות. סיפקנו זרימת עבודה שיטתית החל מהכנת מדגם לניתוח נתונים עבור דגימות קליניות עם כל אמצעי הזהירות הדרושים שיש לנקוט.
Abstract
הניתוח הפרוטאומי של רקמת המוח האנושית בעשור האחרון שיפר מאוד את הבנתנו את המוח. עם זאת, הפרעות הקשורות למוח ממשיכות להיות התורם העיקרי של מקרי מוות ברחבי העולם, המחייב את הצורך בהבנה גדולה עוד יותר של הפתוביולוגיה שלהם. טכניקות מסורתיות המבוססות על נוגדנים כמו סופג מערבי או אימונוהיסטוכימיה סובלות מלהיות תפוקה נמוכה מלבד היותן עתירות עבודה ואיכותיות או חצי כמותיות. אפילו גישות רובה ציד מבוססות ספקטרומטריית מסה קונבנציונליות אינן מספקות ראיות חותכות התומכות בהשערה מסוימת. גישות פרוטאומיות ממוקדות מונעות במידה רבה בהשערות שונות מגישות הפרוטאומיות הקונבנציונליות של רובה הציד שנמצאות בשימוש זמן רב. ניטור תגובה מרובה הוא גישה ממוקדת אחת כזו הדורשת שימוש בספקטרומטר מסה מיוחד הנקרא ספקטרומטר מסה מרובע דו-מושבי או ספקטרומטר מסה מרובע משולש. במחקר הנוכחי, הדגשנו באופן שיטתי את הצעדים העיקריים הכרוכים בביצוע זרימת עבודה מוצלחת של פרוטאומיקה של מסה דו-מושבית המבוססת על ספקטרומטריה באמצעות רקמת מוח אנושית במטרה להציג זרימת עבודה זו לקהילת מחקר רחבה יותר.
Introduction
במהלך העשור האחרון, התפתחויות מהירות בספקטרומטריית מסה (MS) יחד עם הבנה מוגברת של טכניקות כרומטוגרפיה עזרו מאוד בקידום פרוטאומיקה מבוססת טרה-ס. טכניקות מבוססות ביולוגיה מולקולרית כגון סופגות מערביות ואימונוהיסטוכימיה סבלו זה מכבר מבעיות רבייה, זמן תפנית איטי, שונות בין-משקיפה וחוסר יכולתם לכמת במדויק חלבונים, אם להזכיר כמה. לכך, הרגישות המעולה של גישות פרוטאומיות בעלות תפוקה גבוהה ממשיכה להציע לביולוגים מולקולריים כלי חלופי ואמין יותר במסעם להבין טוב יותר את תפקידי החלבונים בתאים. עם זאת, גישות פרוטאומיות רובה ציד (רכישה תלויה נתונים או DDA) לעתים קרובות לא מצליחים לזהות חלבונים בשפע נמוך ברקמות מורכבות מלבד להיות תלוי בכבדות על הרגישות והרזולוציה של המכשיר. במהלך השנים האחרונות, מעבדות ברחבי העולם פיתחו טכניקות כמו רכישה עצמאית של נתונים (DIA) הדורשות כוח מחשוב מוגבר ותוכנות אמינות שיכולות להתמודד עם ערכות נתונים מורכבות אלה. עם זאת, טכניקות אלה הן עדיין עבודה בתהליך ולא מאוד ידידותי למשתמש. גישות פרוטאומיות ממוקדות המבוססות על טרשתות שניה מספקות איזון מושלם בין אופי התפוקה הגבוה של גישות טרשת-בתים לבין הרגישות של גישות ביולוגיה מולקולרית כמו ELISA. ניסוי פרוטאומיקס מבוסס ספקטרומטריית מסה ממוקד מתמקד בזיהוי חלבונים מונעי השערה או פפטידים מניסויי פרוטאומיה מבוססי גילוי או באמצעות ספרות זמינה1,2. ניטור תגובה מרובה (MRM) היא גישה ממוקדת של טרשת נפוצה המשתמשת בספקטרומטר מסה מרובע דו-מושבי לגילוי וכימות מדויקים של חלבונים/פפטידים מדגימות מורכבות. הטכניקה מציעה רגישות וספציפיות גבוהות יותר למרות שהיא דורשת שימוש במכשיר ברזולוציה נמוכה.
ריבוע עשוי מ-4 מוטות מקבילים, כאשר כל מוט מחובר למוט הנגדי באלכסון. שדה משתנה נוצר בין מוטות quadrupole על ידי החלת מתחי RF ו- DC לסירוגין. מסלול היונים בתוך הקוואדרופול מושפע מנוכחותם של אותם מתחים על פני מוטות מנוגדים. על ידי החלת RF על מתח DC, המסלול של היונים ניתן לייצב. זהו מאפיין זה של quadrupole המאפשר לו לשמש כמסנן מסה אשר יכול באופן סלקטיבי לתת יונים ספציפיים לעבור. בהתאם לצורך, ניתן להפעיל ריבוע במצב הסטטי או במצב הסריקה. המצב הסטטי מאפשר רק יונים עם m/z שצוין לעבור, מה שהופך את המצב סלקטיבי מאוד ספציפי ליון של עניין. מצב הסריקה לעומת זאת מאפשר ליונים לאורך כל טווח m/z לעבור. לכן, ספקטרומטר מסה מרובע דו-מושבי יכול לפעול בארבע דרכים אפשריות: i) הרביעייה הראשונה הפועלת במצב סטטי בעוד השני פועל במצב סריקה; ii) הרביעייה הראשונה הפועלת במצב הסריקה בזמן שהשנייה פועלת במצב סטטי; iii) שני הרביעייה הפועלת במצב הסריקה; ו- iv) שני הרביעייה הפועלים במצבסטטי 3. בניסוי MRM טיפוסי, שני הרביעייה פועלים במצב סטטי ומאפשרים למבשרים ספציפיים והמוצרים המתקבלים שלהם לאחר הפיצול להיות במעקב. זה הופך את הטכניקה למאוד רגישה וסלקטיבית ומאפשרת כימות מדויק.
עבור ביולוגים מולקולריים, רקמת המוח האנושית ותאיה הם אוצר בלום. יחידות מדהימות אלה של איבר מעניין מתמיד של גוף האדם יכולות לספק תובנות מולקולריות ותאיות על תפקודו. חקירות פרוטאומיות של רקמת המוח יכולות לא רק לעזור לנו להבין את התפקוד המערכתי של מוח בריא, אלא גם את המסלולים התאיים כי לקבל dysregulated כאשר נגרם על ידי מחלה כלשהי4. עם זאת, רקמת המוח עם כל ההטרוגניות שלה היא איבר מורכב מאוד לנתח ודורש גישה מתואמת להבנה טובה יותר של השינויים ברמה המולקולרית. העבודה הבאה מתארת את כל זרימת העבודה החל החל חילוץ חלבונים מרקמת המוח, יצירת ומיטוב השיטות לבדיקת MRM, לאימות המטרות (איור 1). כאן, הדגשנו באופן שיטתי את הצעדים העיקריים הכרוכים בניסוי מוצלח המבוסס על MRM באמצעות רקמת מוח אנושית במטרה להציג את הטכניקה ואת האתגרים שלה לקהילת מחקר רחבה יותר.
Protocol
Representative Results
Discussion
טכניקות כמו אימונוהיסטוכימיה וכתמים מערביים נחשבו לסטנדרטים של זהב לאימות מטרות חלבון במשך שנים רבות. שיטות אלה מוצאות שימוש גם היום עם שינויים קלים בפרוטוקול ותלות מועטה בטכנולוגיה מה שהופך אותם מסורבלים ומייגע מאוד. מלבד זאת, הם כוללים גם שימוש בנוגדנים יקרים אשר לא תמיד מראים את אותה …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מכירים בפרויקט MHRD-UAY (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), פרויקט #34_IITB למתקן SS ו- MASSFIITB ב- IIT בומביי הנתמך על ידי המחלקה לביוטכנולוגיה (BT / PR13114/ INF / 22/206/2015) לביצוע כל הניסויים הקשורים ל- MS.
אנו מודים למר רשאב ידב על עשייתו ועריכה של הסרטון כולו ולמר נישנט נרוקר על עבודתו בעריכת האודיו.
Materials
| Reagents | |||
| Acetonitrile (MS grade) | Fisher Scientific | A/0620/21 | |
| Bovine Serum Albumin | HiMedia | TC194-25G | |
| Calcium chloride | Fischer Scienific | BP510-500 | |
| Formic acid (MS grade) | Fisher Scientific | 147930250 | |
| Iodoacetamide | Sigma | 1149-25G | |
| Isopropanol (MS grade) | Fisher Scientific | Q13827 | |
| Magnesium Chloride | Fischer Scienific | BP214-500 | |
| Methanol (MS grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| MS grade water | Pierce | 51140 | |
| Phosphate Buffer Saline | HiMedia | TL1006-500ML | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Sodium Chloride | Merck | DF6D661300 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Tris Base | Merck | 648310 | |
| Trypsin (MS grade) | Pierce | 90058 | |
| Urea | Merck | MB1D691237 | |
| Supplies | |||
| Hypersil Gold C18 column | Thermo | 25002-102130 | |
| Micropipettes | Gilson | F167380 | |
| Stage tips | MilliPore | ZTC18M008 | |
| Zirconia/Silica beads | BioSpec products | 11079110z | |
| Equipment | |||
| Bead beater (Homogeniser) | Bertin Minilys | P000673-MLYS0-A | |
| Microplate reader (spectrophotometer) | Thermo | MultiSkan Go | |
| pH meter | Eutech | CyberScan pH 510 | |
| Probe Sonicator | Sonics Materials, Inc | VCX 130 | |
| Shaking Drybath | Thermo | 88880028 | |
| TSQ Altis mass spectrometer | Thermo | TSQ02-10002 | |
| uHPLC – Vanquish | Thermo | VQF01-20001 | |
| Vacuum concentrator | Thermo | Savant ISS 110 |
References
- Picotti, P., Aebersold, R. Selected reaction monitoring-based proteomics: Workflows, potential, pitfalls and future directions. Nature Methods. , (2012).
- Carr, S. A., et al. Targeted peptide measurements in biology and medicine: Best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach. Molecular and Cellular Proteomics. 13 (3), 907-917 (2014).
- Pitt, J. J. Principles and applications of liquid chromatography-mass spectrometry in clinical biochemistry. The Clinical biochemist Reviews. 30 (1), 19-34 (2009).
- Hosp, F., Mann, M. A Primer on Concepts and Applications of Proteomics in Neuroscience. Neuron. 96 (3), 558-571 (2017).
- Scopes, R. K. Measurement of protein by spectrophotometry at 205 nm. Analytical Biochemistry. , (1974).
- Kusebauch, U., et al. Human SRMAtlas: A Resource of Targeted Assays to Quantify the Complete Human Proteome. Cell. , (2016).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
- Gerber, S. A., Rush, J., Stemman, O., Kirschner, M. W., Gygi, S. P. Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2003).
- Escher, C., et al. Using iRT, a normalized retention time for more targeted measurement of peptides. Proteomics. , (2012).
- Gillette, M. A., Carr, S. A. Quantitative analysis of peptides and proteins in biomedicine by targeted mass spectrometry. Nature Methods. 10 (1), 28-34 (2013).
- Whiteaker, J. R., et al. A targeted proteomics-based pipeline for verification of biomarkers in plasma. Nature Biotechnology. , (2011).
- Hüttenhain, R., et al. Reproducible quantification of cancer-associated proteins in body fluids using targeted proteomics. Science Translational Medicine. 4 (142), 94 (2012).
- Mermelekas, G., Vlahou, A., Zoidakis, J. SRM/MRM targeted proteomics as a tool for biomarker validation and absolute quantification in human urine. Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (11), 1441-1454 (2015).
- Koldamova, R. P., Lefterov, I. M., Lefterova, M. I., Lazo, J. S. Apolipoprotein A-I directly interacts with amyloid precursor protein and inhibits Aβ aggregation and toxicity. 생화학. , (2001).
- Jiang, S. X., Slinn, J., Aylsworth, A., Hou, S. T. Vimentin participates in microglia activation and neurotoxicity in cerebral ischemia. Journal of Neurochemistry. , (2012).
- Liu, L. Y., et al. Nicotinamide Phosphoribosyltransferase May Be Involved in Age-Related Brain Diseases. PLoS ONE. , (2012).
- Abbatiello, S., et al. New guidelines for publication of manuscripts describing development and application of targeted mass spectrometry measurements of peptides and proteins. Molecular and Cellular Proteomics. 16 (3), 327-328 (2017).
