نموذج ثقافة الخلية Adipocyte لدراسة تأثير البروتين وتعديل الحمض النووي الريبي الدقيق على وظيفة Adipocyte
Summary
يقدم هنا بروتوكول لتسليم أوليغونوكليوتيدات مثل الحمض النووي الريبي (siRNA) صغير التدخل ، أو محاكاة الحمض النووي الريبي الدقيق (miRs) ، أو الحمض النووي الريبي المضاد للميكروبات (anti-miR) في الخلايا الدهنية الناضجة لتعديل البروتين والتعبير عن الحمض النووي الريبي الدقيق.
Abstract
تغيير وظيفة adipocyte يساهم في الإمراض من أمراض التمثيل الغذائي بما في ذلك مرض السكري من النوع 2 ومقاومة الأنسولين. وهذا يسلط الضوء على الحاجة إلى فهم أفضل للآلية الجزيئية المشاركة في خلل الخلايا الدهنية لتطوير علاجات جديدة ضد الأمراض المرتبطة بالسمنة. تعديل التعبير عن البروتينات والرنانات الدقيقة في الخلايا الدهنية لا يزال تحديا كبيرا. تصف هذه الورقة بروتوكولا للتمييز بين الخلايا الليفية المورينية إلى خلايا شحمية ناضجة وتعديل التعبير عن البروتينات والحمى الريبية الدقيقة في الخلايا الدهنية الناضجة من خلال العدوى العكسية باستخدام الحمض النووي الريبي الصغير التدخل (siRNA) وتقليد الحمض النووي الريبي الدقيق (تقليد miR) أوليغونوكليوتيدات. يتضمن بروتوكول العدوى العكسي هذا احتضان كاشف العدوى والوليغونوكليوتيدات لتشكيل مركب في لوحة زراعة الخلية التي تضاف إليها الخلايا الدهنية الناضجة. ثم يسمح للخلايا الشحمية بإعادة ربطها بسطح اللوحة الملتصقة في وجود مجمع كاشف أوليغونوكليوتيدات /ترانسفيكتيون. يمكن إجراء التحليلات الوظيفية مثل دراسة إشارات الأنسولين ، امتصاص الجلوكوز ، تكوين الدهون ، وانحلال الدهون على الخلايا الدهنية الناضجة 3T3-L1 المتحولة لدراسة تأثير التلاعب بالبروتين أو الحمض النووي الريبي الدقيق على وظيفة الخلايا الدهنية.
Introduction
تعتبر السمنة عامل خطر رئيسي للعديد من أمراض التمثيل الغذائي، بما في ذلك مقاومة الأنسولين (IR)، داء السكري من النوع 2 (T2D)، وأمراض القلب والأوعية الدموية1. وقد فشلت العلاجات الحالية في وقف الانتشار المتزايد باستمرار لهذه الأمراض ، وإدارة الأشعة تحت الحمراء لمرضى السمنة والسكري لا تزال قضية سريرية هامة. الأنسجة الدهنية تلعب دورا حاسما في السيطرة على التوازن الطاقة، وتوسعها المرضي خلال السمنة يساهم في تطوير الأشعة تحت الحمراء و T2D2،3. وهذا يسلط الضوء على الحاجة إلى فهم أفضل للآلية الجزيئية المشاركة في خلل الخلايا الدهنية لتطوير علاجات جديدة ضد الأمراض المرتبطة بالسمنة. وقد بحثت العديد من الدراسات البحثية دور الحمض النووي الريبي ترميز البروتين في فسيولوجيا الخلايا الدهنية وارتباطها مع السمنة.
وفي الآونة الأخيرة، أدى اكتشاف الرناس غير الترميزي، ولا سيما الرنانات الصغرى، إلى صياغة مفاهيم جديدة تتعلق بآلية تنظيم برامج التعبير الجيني. وقد أظهرت الدراسات أن ncRNAs هي المنظمين المهمين لوظيفة adipocyte، وأن dysregulation بهم يلعب دورا هاما في أمراض التمثيل الغذائي4. وبالتالي ، فإن التلاعب بالبروتينات وnCRAS في الخلايا الدهنية أمر بالغ الأهمية لفك أدوارها في وظيفة الخلايا الدهنية وتأثيرها على الأمراض مثل T2D. ومع ذلك ، فإن التلاعب في التعبير عن البروتينات وnCRAS في الجسم الحي وكذلك في الخلايا الدهنية الأولية لا يزال صعبا للغاية ، ويفضل استخدام نماذج الخلايا الدهنية في المختبر.
مورين 3T3-L1 الخلايا الليفية تفرق بسهولة إلى الخلايا الدهنية ناضجة، وظيفية، واستجابة للأنسولين، والتي هي خط الخلية ذات الخصائص الجيدة المستخدمة لدراسة وظيفة adipocyte (على سبيل المثال، إشارات الأنسولين، امتصاص الجلوكوز، انحلال الدهون وإفراز الدهون)5،6،7،8،9،10. هذه الخصائص تجعل 3T3-L1 adipocytes نموذجا جذابا لتعديل التعبير عن البروتين الترميز وNNC-RNAs لفك دورها في وظيفة الدهون ودورها المحتمل في الأمراض المرتبطة بالسمنة. لسوء الحظ ، في حين أن الخلايا الليفية 3T3-L1 سهلة التحميب باستخدام الكواشف المتاحة تجاريا ، فإن الخلايا الدهنية 3T3-L1 المتمايزة هي واحدة من أصعب خطوط الخلايا للمتحولين. هذا هو السبب في أن العديد من الدراسات التي تتلاعب بالتعبير الجيني في خلايا 3T3-L1 ركزت على تمايز الخلايا الدهنية بدلا من التركيز على وظيفة الخلايا الدهنية.
لفترة طويلة ، كانت التقنية الفعالة الوحيدة لخلايا الدهون المتحولة هي الكهربورات5، وهي مملة ومكلفة ويمكن أن تسبب تلفا في الخلايا. تشير هذه الورقة إلى تقنية عكس العدوى باستخدام كاشف العدوى الشائع ، مما يقلل من الوقت العملي للإصابة ، وليس له أي تأثير على صلاحية الخلية ، وهو أقل تكلفة بكثير من الإلكتربو. هذا البروتوكول مناسب تماما لإصابة سيرنا وغيرها من أوليغونوكليوتيدات مثل محاكاة الحمض النووي الريبي الدقيق (تقليد مير) ومكافحة مير. مبدأ بروتوكول عكس العدوى هو احتضان كاشف العدوى والوليغونوكليوتيدات لتشكيل مجمع في لوحة ثقافة الخلية ومن ثم زرع الخلايا الدهنية الناضجة في الآبار. ثم، إعادة ربط الخلايا الشحمية إلى سطح لوحة ملتصقة في وجود مجمع كاشف أوليغونوكليوتيدات / العدوى. تسمح هذه المنهجية البسيطة والفعالة وغير المكلفة بدراسة دور الحمض النووي الريبي وترميز البروتين وmiRs في وظيفة الخلايا الدهنية ودورها المحتمل في الأمراض المرتبطة بالسمنة.
Protocol
Representative Results
Discussion
تقدم هذه الورقة بروتوكولا مفصلا للتمايز وإعادة العدوى بالخلايا الدهنية الناضجة. طريقة العدوى العكسية هذه هي طريقة بسيطة واقتصادية وفعالة للغاية لمضادات الميكروبات مثل ، على سبيل المثال لا الحصر ، siRNAs ، محاكاة الحمض النووي الريبي الدقيق ، ومضادات الحمض النووي الريبي الدقيق إلى خلايا 3T3-L1 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل كل من معهد البحوث الدولية، وجامعة كوت دازور، والوكالة الوطنية الفرنسية للبحوث من خلال برنامج الاستثمارات من أجل مختبر التميز المستقبلي (Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01) ومبادرة التميز (Idex UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001). 10- وتحظى الجمعية العامة بدعم المنح المقدمة من جمعية الفرانكوفونية للديابييه، وجمعية فرانسيز دي إيتو دي ريشرش سور لوبيستيه، ومعهد التكنولوجيات المتعددة الكائنات من أجل سانتي، ومؤسسة بنجامين – ديهرت. J.G. معتمد من قبل ANR-18-CE14-0035-01. J-F.T. مدعوم بمنحة ANR ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01 ومنحة من مؤسسة من أجل Recherche Médicale (Equipe FRM, DEQ20180839587). كما نشكر مرفق التصوير الأساسي C3M الممول من مجلس إدارة ألب ماريتيم وريجيون باكا، والذي يدعمه أيضا منصة التصوير المجهري والتصوير GIS IBiSA Côte d’Azur (MICA).
Materials
| 12 well Tissue Culture Plate | Dutscher | 353043 | |
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090-046 | diluted to 5x with D-PBS |
| 2-Propanol | Sigma | I9516 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Accell Non-targeting Pool | Horizon Discovery | D-001910-10-05 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Collagen type I from calf skin | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| D-PBS | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagles's Medium (DMEM) | Gibco | 41965062 | 4.5 g/L D-Glucose; L-Glutamine; no Pyruvate |
| Ethanol | Sigma | 51976 | |
| FAM-labeled Negative Control si-RNA | Invitrogen | AM4620 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| Free Glycerol Reagent | Sigma-Aldrich | F6428 | |
| Glycerol Standard Solution | Sigma-Aldrich | G7793 | |
| HSP90 antibody | Santa Cruz | sc-131119 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Improved Minimal Essential Medium (Opti-MEM) | Gibco | 31985-047 | |
| Insulin, Human Recombinant | Gibco | 12585-014 | |
| miRIDIAN micro-RNA mimics | Horizon Discovery | ||
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| miScript II RT Kit | Qiagen | 218161 | |
| miScript Primer Assays Hs_RNU6-2_11 | Qiagen | MS00033740 | |
| miScript Primer Assays Mm_miR-34a_1 | Qiagen | MS00001428 | |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 219073 | |
| Newborn Calf Serum | Gibco | 16010-159 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool | Horizon Discovery | L-056623-01-0005 | |
| Penicillin and Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Perilipin-1 antibody | Cell Signaling | 3470 | Dilution : 1/1000 |
| Petri dish 100 mm x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
| PKB antibody | Cell Signaling | 9272 | Dilution : 1/1000 |
| PKB Phospho Thr308 antibody | Cell Signaling | 9275 | Dilution : 1/1000 |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Transfection reagent (INTERFERin) | Polyplus | 409-10 | |
| α-tubulin antibody | Sigma aldrich | T6199 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Vamp2 antibody | R&D Systems | MAB5136 | Dilution : 0.1 µg/mL |
References
- Klöting, N., et al. Insulin-sensitive obesity. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 299 (3), 506-515 (2010).
- Weyer, C., Foley, J. E., Bogardus, C., Tataranni, P. A., Pratley, R. E. Enlarged subcutaneous abdominal adipocyte size, but not obesity itself, predicts type II diabetes independent of insulin resistance. Diabetologia. 43 (12), 1498-1506 (2000).
- Blüher, M. Adipose tissue dysfunction contributes to obesity related metabolic diseases. Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism. 27 (2), 163-177 (2013).
- Lorente-Cebrián, S., González-Muniesa, P., Milagro, F. I., Martínez, J. A. MicroRNAs and other non-coding RNAs in adipose tissue and obesity: emerging roles as biomarkers and therapeutic targets. Clinical Science. 133 (1), 23-40 (2019).
- Jager, J., et al. Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis. Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).
- Vergoni, B., et al. DNA damage and the activation of the p53 pathway mediate alterations in metabolic and secretory functions of adipocytes. Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).
- Berthou, F., et al. The Tpl2 kinase regulates the COX-2/prostaglandin E2 axis in adipocytes in inflammatory conditions. Molecular Endocrinology. 29 (7), 1025-1036 (2015).
- Ceppo, F., et al. Implication of the Tpl2 kinase in inflammatory changes and insulin resistance induced by the interaction between adipocytes and macrophages. Endocrinology. 155 (3), 951-964 (2014).
- Jager, J., Grémeaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. -. F. Interleukin-1beta-induced insulin resistance in adipocytes through down-regulation of insulin receptor substrate-1 expression. Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).
- Jager, J., et al. Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis. Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).
- Hart, M., et al. miR-34a as hub of T cell regulation networks. Journal of ImmunoTherapy of Cancer. 7, 187 (2019).
- Brandenburger, T., et al. MiR-34a is differentially expressed in dorsal root ganglia in a rat model of chronic neuropathic pain. Neuroscience Letters. 708, 134365 (2019).
