Un modello di coltura cellulare di adipociti per studiare l'impatto della modulazione di proteine e micro-RNA sulla funzione degli adipociti
Summary
Qui viene presentato un protocollo per fornire oligonucleotidi come RNA a piccola interferenza (siRNA), imitazioni di micro-RNA (miR) o anti-micro-RNA (anti-miR) in adipociti maturi per modulare l’espressione di proteine e micro-RNA.
Abstract
L’alterazione della funzione degli adipociti contribuisce alla patogenesi delle malattie metaboliche tra cui il diabete di tipo 2 e l’insulino-resistenza. Ciò evidenzia la necessità di comprendere meglio il meccanismo molecolare coinvolto nella disfunzione degli adipociti per sviluppare nuove terapie contro le malattie legate all’obesità. Modulare l’espressione di proteine e micro-RNA negli adipociti rimane molto impegnativo. Questo articolo descrive un protocollo per differenziare i fibroblasti murini in adipociti maturi e per modulare l’espressione di proteine e micro-RNA negli adipociti maturi attraverso la trasfezione inversa utilizzando oligonucleotidi a RNA a interferenza piccola (siRNA) e micro-RNA che imitano (miR mimic). Questo protocollo di trasfezione inversa prevede l’incubazione del reagente di trasfezione e degli oligonucleotidi per formare un complesso nella piastra di coltura cellulare a cui vengono aggiunti gli adipociti maturi. Gli adipociti sono quindi autorizzati a riattaccarsi alla superficie della piastra aderente in presenza del complesso oligonucleotidi/reagente di trasfezione. Analisi funzionali come lo studio della segnalazione dell’insulina, dell’assorbimento del glucosio, della lipogenesi e della lipolisi possono essere eseguite sugli adipociti maturi 3T3-L1 trasfetti per studiare l’impatto della manipolazione di proteine o micro-RNA sulla funzione degli adipociti.
Introduction
L’obesità è considerata un importante fattore di rischio per numerose malattie metaboliche, tra cui la resistenza all’insulina (IR), il diabete di tipo 2 (T2D) e le malattie cardiovascolari1. Le terapie attuali non sono riuscite a fermare la prevalenza in costante aumento di queste malattie e la gestione dell’IR di pazienti obesi e diabetici rimane un importante problema clinico. Il tessuto adiposo svolge un ruolo cruciale nel controllo dell’omeostasi energetica e la sua espansione patologica durante l’obesità contribuisce allo sviluppo di IR e T2D2,3. Ciò evidenzia la necessità di comprendere meglio il meccanismo molecolare coinvolto nella disfunzione degli adipociti per sviluppare nuove terapie contro le malattie legate all’obesità. Molti studi di ricerca hanno studiato il ruolo degli RNA codificanti proteine nella fisiologia degli adipociti e la loro associazione con l’obesità.
Più recentemente, la scoperta di RNA non codificanti (ncRNA), in particolare micro-RNA (miR), ha forgiato nuovi concetti relativi al meccanismo di regolazione dei programmi di espressione genica. Gli studi hanno dimostrato che gli ncRNA sono importanti regolatori della funzione degli adipociti e che la loro disregolazione svolge un ruolo importante nelle malattie metaboliche4. Pertanto, la manipolazione di proteine e ncRNA negli adipociti è cruciale per decifrare il loro ruolo nella funzione degli adipociti e il loro impatto su patologie come il T2D. Tuttavia, manipolare l’espressione di proteine e ncRNA in vivo e negli adipociti primari rimane molto impegnativo, favorendo l’uso di modelli di adipociti in vitro.
I fibroblasti murini 3T3-L1 si differenziano facilmente in adipociti maturi, funzionali e insulino-responsi, che sono una linea cellulare ben caratterizzata utilizzata per studiare la funzione degli adipociti (ad esempio, segnalazione di insulina, assorbimento di glucosio, lipolisi e secrezione di adipochine)5,6,7,8,9,10. Queste proprietà rendono gli adipociti 3T3-L1 un modello interessante per modulare l’espressione di proteina-codifica e nc-RNA per decifrare il loro ruolo nella funzione degli adipociti e il loro potenziale ruolo nelle malattie legate all’obesità. Sfortunatamente, mentre i fibroblasti 3T3-L1 sono facili da trasfettare utilizzando reagenti disponibili in commercio, gli adipociti 3T3-L1 differenziati sono una delle linee cellulari più difficili da trasfettare. Questo è il motivo per cui numerosi studi che manipolano l’espressione genica nelle cellule 3T3-L1 si sono concentrati sulla differenziazione degli adipociti piuttosto che sulla funzione degli adipociti.
Per molto tempo, l’unica tecnica efficiente per trasfezionare gli adipociti è stata l’elettroporazione5, che è noiosa, costosa e può causare danni alle cellule. Questo documento riporta una tecnica di trasfezione inversa che utilizza un reagente di trasfezione comune, che riduce il tempo pratico per la trasfezione, non ha alcun effetto sulla vitalità cellulare ed è molto meno costoso dell’elettroporazione. Questo protocollo è perfettamente adatto per la trasfezione di siRNA e altri oligonucleotidi come i micro-RNA mimics (miR mimics) e anti-miRs. Il principio del protocollo di trasfezione inversa è quello di incubare il reagente di trasfezione e gli oligonucleotidi per formare un complesso nella piastra di coltura cellulare e quindi seminare gli adipociti maturi nei pozzetti. Quindi, gli adipociti si riattaccano alla superficie della piastra aderente in presenza del complesso oligonucleotidi/reagente di trasfezione. Questa metodologia semplice, efficiente e poco costosa consente di studiare il ruolo degli RNA e dei miR codificanti proteine nella funzione degli adipociti e il loro potenziale ruolo nelle malattie legate all’obesità.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo documento presenta un protocollo dettagliato per la differenziazione e la trasfezione di adipociti maturi. Questo metodo di trasfezione inversa è un metodo semplice, economico e altamente efficiente per trasfettare oligonucleotidi come, ma non solo, siRNA, imitazioni di micro-RNA e anti-micro-RNA in adipociti 3T3-L1, che è una delle linee cellulari più difficili da trasfettare. Questo metodo ha alcune limitazioni che devono essere considerate. Questo protocollo non è efficiente per la trasfezione con DNA plasm…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dall’INSERM, dall’Université Côte d’Azur e dall’Agenzia Nazionale francese per la ricerca (ANR) attraverso il programma Investimenti per il futuro Laboratorio di Eccellenza (Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01) e Initiative of Excellence (Idex UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001). J.J. è sostenuta da sovvenzioni della Société Francophone du Diabète (SFD), dell’Association Française d’Etude et de Recherche sur l’Obésité (AFERO), dell’Institut Thématique Multi-Organismes Technologies pour la Santé (ITMO) e della Fondation Benjamin-Delessert. J.G. è supportato da ANR-18-CE14-0035-01. J-F.T. è sostenuta dalla sovvenzione ANR ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01 e da una sovvenzione della Fondation pour la Recherche Médicale (Equipe FRM, DEQ20180839587). Ringraziamo anche l’Imaging Core Facility di C3M finanziato dal Conseil Départemental des Alpes-Maritimes e dalla Région PACA, che è anche supportato dalla GIS IBiSA Microscopy and Imaging Platform Côte d’Azur (MICA).
Materials
| 12 well Tissue Culture Plate | Dutscher | 353043 | |
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090-046 | diluted to 5x with D-PBS |
| 2-Propanol | Sigma | I9516 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Accell Non-targeting Pool | Horizon Discovery | D-001910-10-05 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Collagen type I from calf skin | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| D-PBS | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagles's Medium (DMEM) | Gibco | 41965062 | 4.5 g/L D-Glucose; L-Glutamine; no Pyruvate |
| Ethanol | Sigma | 51976 | |
| FAM-labeled Negative Control si-RNA | Invitrogen | AM4620 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| Free Glycerol Reagent | Sigma-Aldrich | F6428 | |
| Glycerol Standard Solution | Sigma-Aldrich | G7793 | |
| HSP90 antibody | Santa Cruz | sc-131119 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Improved Minimal Essential Medium (Opti-MEM) | Gibco | 31985-047 | |
| Insulin, Human Recombinant | Gibco | 12585-014 | |
| miRIDIAN micro-RNA mimics | Horizon Discovery | ||
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| miScript II RT Kit | Qiagen | 218161 | |
| miScript Primer Assays Hs_RNU6-2_11 | Qiagen | MS00033740 | |
| miScript Primer Assays Mm_miR-34a_1 | Qiagen | MS00001428 | |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 219073 | |
| Newborn Calf Serum | Gibco | 16010-159 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool | Horizon Discovery | L-056623-01-0005 | |
| Penicillin and Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Perilipin-1 antibody | Cell Signaling | 3470 | Dilution : 1/1000 |
| Petri dish 100 mm x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
| PKB antibody | Cell Signaling | 9272 | Dilution : 1/1000 |
| PKB Phospho Thr308 antibody | Cell Signaling | 9275 | Dilution : 1/1000 |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Transfection reagent (INTERFERin) | Polyplus | 409-10 | |
| α-tubulin antibody | Sigma aldrich | T6199 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Vamp2 antibody | R&D Systems | MAB5136 | Dilution : 0.1 µg/mL |
References
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