Un modelo de cultivo celular de adipocitos para estudiar el impacto de la modulación de proteínas y microARN en la función de los adipocitos
Summary
Aquí se presenta un protocolo para administrar oligonucleótidos como ARN de interferencia pequeña (siRNA), imitadores de microARN (miR) o anti-micro-ARN (anti-miR) en adipocitos maduros para modular la expresión de proteínas y microARN.
Abstract
La alteración de la función de los adipocitos contribuye a la patogénesis de enfermedades metabólicas como la diabetes tipo 2 y la resistencia a la insulina. Esto pone de relieve la necesidad de comprender mejor el mecanismo molecular implicado en la disfunción de los adipócitos para desarrollar nuevas terapias contra las enfermedades relacionadas con la obesidad. Modular la expresión de proteínas y micro-ARN en los adipocitos sigue siendo un gran desafío. Este artículo describe un protocolo para diferenciar los fibroblastos murinos en adipocitos maduros y para modular la expresión de proteínas y micro-ARN en adipocitos maduros a través de la transfección inversa utilizando oligonucleótidos de ARN de interferencia pequeña (siRNA) y micro-ARN imitador (miR mimic). Este protocolo de transfección inversa implica la incubación del reactivo de transfección y los oligonucleótidos para formar un complejo en la placa de cultivo celular al que se añaden los adipocitos maduros. Luego se permite que los adipocitos se vuelvan a unir a la superficie de la placa adherente en presencia del complejo oligonucleótidos / reactivo de transfección. Se pueden realizar análisis funcionales como el estudio de la señalización de insulina, la captación de glucosa, la lipogénesis y la lipólisis en los adipocitos maduros 3T3-L1 transfectados para estudiar el impacto de la manipulación de proteínas o microARN en la función de los adipocitos.
Introduction
La obesidad se considera un factor de riesgo importante para numerosas enfermedades metabólicas, incluida la resistencia a la insulina (RI), la diabetes tipo 2 (DT2) y las enfermedades cardiovasculares1. Las terapias actuales no han logrado detener la prevalencia en constante aumento de estas enfermedades, y el manejo de la RI de pacientes obesos y diabéticos sigue siendo un problema clínico importante. El tejido adiposo juega un papel crucial en el control de la homeostasis energética, y su expansión patológica durante la obesidad contribuye al desarrollo de IR y DT22,3. Esto pone de relieve la necesidad de comprender mejor el mecanismo molecular implicado en la disfunción de los adipócitos para desarrollar nuevas terapias contra las enfermedades relacionadas con la obesidad. Muchos estudios de investigación han investigado el papel de los ARN codificantes de proteínas en la fisiología de los adipocitos y su asociación con la obesidad.
Más recientemente, el descubrimiento de los ARN no codificantes (NCRNAs), especialmente los micro-RNAs (miRs), ha forjado conceptos novedosos relacionados con el mecanismo de regulación de los programas de expresión génica. Los estudios han demostrado que los ncRNAs son importantes reguladores de la función de los adipocitos, y que su desregulación juega un papel importante en las enfermedades metabólicas4. Así, la manipulación de proteínas y ncRNAs en adipocitos es crucial para descifrar sus papeles en la función de los adipocitos y su impacto en patologías como la DT2. Sin embargo, la manipulación de la expresión de proteínas y ncRNAs in vivo, así como en adipocitos primarios sigue siendo un gran desafío, favoreciendo el uso de modelos de adipocitos in vitro.
Los fibroblastos murinos 3T3-L1 se diferencian fácilmente en adipocitos maduros, funcionales y sensibles a la insulina, que son una línea celular bien caracterizada utilizada para estudiar la función de los adipocitos (por ejemplo, señalización de insulina, captación de glucosa, lipólisis y secreción de adipoquinas)5,6,7,8,9,10. Estas propiedades hacen de los adipocitos 3T3-L1 un modelo atractivo para modular la expresión de los arneses codificantes de proteínas y nc-ARN para descifrar su papel en la función de los adipocitos y su papel potencial en las enfermedades relacionadas con la obesidad. Desafortunadamente, mientras que los fibroblastos 3T3-L1 son fáciles de transfectar utilizando reactivos disponibles comercialmente, los adipocitos 3T3-L1 diferenciados son una de las líneas celulares más difíciles de transfectar. Esta es la razón por la que numerosos estudios que manipulan la expresión génica en células 3T3-L1 se han centrado en la diferenciación de adipocitos en lugar de en la función de los adipocitos.
Durante mucho tiempo, la única técnica eficiente para transfectar adipocitos fue la electroporación5,que es tediosa, costosa y puede causar daño celular. Este artículo informa una técnica de transfección inversa que utiliza un reactivo de transfección común, que reduce el tiempo práctico para la transfección, no tiene ningún efecto sobre la viabilidad celular y es mucho menos costoso que la electroporación. Este protocolo es perfectamente adecuado para la transfección de siRNA y otros oligonucleótidos como imitadores de micro-ARN (imitadores de miR) y anti-miRs. El principio del protocolo de transfección inversa es incubar el reactivo de transfección y los oligonucleótidos para formar un complejo en la placa de cultivo celular y luego sembrar los adipocitos maduros en los pozos. Luego, los adipocitos se vuelven a unir a la superficie de la placa adherente en presencia del complejo oligonucleótidos / reactivo de transfección. Esta metodología simple, eficiente y económica permite estudiar el papel de los ARN y miR codificantes de proteínas en la función de los adipocitos y su papel potencial en las enfermedades relacionadas con la obesidad.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este trabajo presenta un protocolo detallado para la diferenciación y transfección de adipocitos maduros. Este método de transfección inversa es un método simple, económico y altamente eficiente para transfectar oligonucleótidos como, entre otros, siRNAs, imitadores de micro-ARN y anti-micro-ARN en adipocitos 3T3-L1, que es una de las líneas celulares más difíciles de transfectar. Este método tiene algunas limitaciones que deben considerarse. Este protocolo no es eficiente para la transfección con ADN plásmi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el INSERM, la Université Côte d’Azur y la Agencia Nacional de Investigación de Francia (ANR) a través del programa Inversiones para el futuro Laboratorio de Excelencia (Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01) e Iniciativa de Excelencia (Idex UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001). J.J. cuenta con el apoyo de subvenciones de la Société Francophone du Diabète (SFD), la Association Française d’Etude et de Recherche sur l’Obésité (AFERO), el Institut Thématique Multi-Organismes Technologies pour la Santé (ITMO) y la Fondation Benjamin-Delessert. J.G. cuenta con el apoyo de ANR-18-CE14-0035-01. J-F.T. cuenta con el apoyo de la subvención ANR ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01 y una subvención de la Fondation pour la Recherche Médicale (Equipe FRM, DEQ20180839587). También agradecemos la Instalación Central de Imágenes de C3M financiada por el Conseil Départemental des Alpes-Maritimes y la Région PACA, que también cuenta con el apoyo de la Plataforma de Microscopía e Imágenes GIS IBiSA Côte d’Azur (MICA).
Materials
| 12 well Tissue Culture Plate | Dutscher | 353043 | |
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090-046 | diluted to 5x with D-PBS |
| 2-Propanol | Sigma | I9516 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Accell Non-targeting Pool | Horizon Discovery | D-001910-10-05 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Collagen type I from calf skin | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| D-PBS | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagles's Medium (DMEM) | Gibco | 41965062 | 4.5 g/L D-Glucose; L-Glutamine; no Pyruvate |
| Ethanol | Sigma | 51976 | |
| FAM-labeled Negative Control si-RNA | Invitrogen | AM4620 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| Free Glycerol Reagent | Sigma-Aldrich | F6428 | |
| Glycerol Standard Solution | Sigma-Aldrich | G7793 | |
| HSP90 antibody | Santa Cruz | sc-131119 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Improved Minimal Essential Medium (Opti-MEM) | Gibco | 31985-047 | |
| Insulin, Human Recombinant | Gibco | 12585-014 | |
| miRIDIAN micro-RNA mimics | Horizon Discovery | ||
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| miScript II RT Kit | Qiagen | 218161 | |
| miScript Primer Assays Hs_RNU6-2_11 | Qiagen | MS00033740 | |
| miScript Primer Assays Mm_miR-34a_1 | Qiagen | MS00001428 | |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 219073 | |
| Newborn Calf Serum | Gibco | 16010-159 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool | Horizon Discovery | L-056623-01-0005 | |
| Penicillin and Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Perilipin-1 antibody | Cell Signaling | 3470 | Dilution : 1/1000 |
| Petri dish 100 mm x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
| PKB antibody | Cell Signaling | 9272 | Dilution : 1/1000 |
| PKB Phospho Thr308 antibody | Cell Signaling | 9275 | Dilution : 1/1000 |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Transfection reagent (INTERFERin) | Polyplus | 409-10 | |
| α-tubulin antibody | Sigma aldrich | T6199 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Vamp2 antibody | R&D Systems | MAB5136 | Dilution : 0.1 µg/mL |
References
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