아디포세포 기능에 대한 단백질 및 마이크로 RNA 변조의 영향을 연구하는 세포 배양 모델
Summary
여기에 제시된 것은 단백질과 마이크로 RNA 발현을 조절하기 위해 성숙한 아디포사이클로 작은 간섭 RNA(siRNA), 마이크로 RNA 모방(miRs), 또는 항마이크로RNA(anti-miR)와 같은 올리고뉴클레오티드를 전달하는 프로토콜이다.
Abstract
adipocyte 기능의 변경은 타입-2 당뇨병및 인슐린 저항을 포함하여 신진 대사 질병의 병발생에 기여합니다. 이것은 비만 관련 질병에 대하여 새로운 치료를 개발하기 위하여 안증 기능 장애에 관련시킨 분자 기계장치를 더 잘 이해하는 필요를 강조합니다. 지방세포에서 단백질과 마이크로 RNA의 발현을 조절하는 것은 여전히 매우 어려운 일입니다. 이 논문은 소염성 RNA(siRNA) 및 마이크로 RNA 모방(miR 모방) 올리고뉴클레오티드를 사용하여 후색 성 전환체에서 단백질과 마이크로 RNA의 발현을 조절하고, 소염포 세포로 소명 섬유아세포를 분화시키는 프로토콜을 설명합니다. 이러한 역형 형질 프로토콜은 성숙한 송신세포가 첨가되는 세포 배양판에서 복합체를 형성하기 위해 트랜스페션 시약및 올리고뉴클레오티드의 배양을 포함한다. 그런 다음 고뉴클레오티드/트랜스페트 시약 복합체가 있는 경우 부착판 표면에 다시 부착할 수 있다. 인슐린 신호, 포도당 섭취, 리포발생 및 lipolypolysis의 연구와 같은 기능성 분석은 단백질 또는 마이크로 RNA 조작이 백혈구 기능에 미치는 영향을 연구하기 위해 트랜스페드 3T3-L1 성숙한 지방세포에서 수행될 수 있다.
Introduction
비만은 인슐린 저항성 (IR), 타입-2 당뇨병 (T2D), 및 심장 혈관 질병을 포함하여 수많은 신진 대사 질병을 위한 중요한 위험 요소로 간주됩니다1. 현재 치료는 이 질병의 끊임없이 상승 보급을 중단하는 것을 실패하고, 비만과 당뇨병 환자의 IR의 관리는 중요한 임상 문제점 남아 있습니다. 지방 조직은 에너지 항상성의 제어에 중요한 역할을하며, 비만 중 병리학적 확장은 IR 및 T2D2,3의개발에 기여한다. 이것은 비만 관련 질병에 대하여 새로운 치료를 개발하기 위하여 안증 기능 장애에 관련시킨 분자 기계장치를 더 잘 이해하는 필요를 강조합니다. 많은 연구 결과는 지방 세포 생리학에 있는 단백질 코딩 RNA의 역할 및 비만과의 그들의 협회를 조사했습니다.
최근에는 비코딩 RNA(ncRNA), 특히 마이크로 RNA(miRs)의 발견은 유전자 발현 프로그램의 조절 메커니즘과 관련된 새로운 개념을 위조했다. 연구 결과는 ncRNA가 adipocyte 기능의 중요한 레귤레이터이고, 그들의 dysregulation는 신진 대사 질병4에중요한 역할을 한다는 것을 보여주었습니다. 따라서, 백심세포에서 단백질과 ncRNA의 조작은 백혈구 기능에서 그들의 역할및 T2D와 같은 병리에 그들의 충격을 해독하기 위하여 결정적입니다. 그러나, 생체 내뿐만 아니라 1 차 성 구도에서 단백질과 ncRNAs의 발현을 조작하는 것은 시험관 내 분비 세포의 사용을 선호, 매우 도전 남아있다.
Murine 3T3-L1 섬유아세포는 성숙하고 기능적이며 인슐린 반응성 세포세포로 쉽게 분화되며, 이는 세포세포를 연구하는 데 사용되는 잘 특징적인 세포주(예를 들어, 인슐린 신호, 포도당 섭취, lipolysis 및 adipokines 분비)5,6,7,8,9,10. 이러한 특성은 3T3-L1 아디포사이클을 단백질 코딩 및 NC-RNA의 발현을 조절하여 안도 세포 기능에서의 역할과 비만 관련 질환에서의 잠재적 역할을 해독하는 매력적인 모델입니다. 불행히도, 3T3-L1 섬유아세포는 시판기 시약을 사용하여 쉽게 트랜스펙트를 할 수 있지만, 분화된 3T3-L1 세포세포는 트랜스펙트에 가장 어려운 세포주 중 하나입니다. 이것이 3T3-L1 세포에서 유전자 발현을 조작하는 수많은 연구가 교포세포 기능보다는 지방세포 분화에 초점을 맞춘 이유입니다.
장시간, 선포세포를 경화시키는 유일한 효율적인 기술은전기기공5였으며,이는 지루하고 비용이 많이 들며 세포 손상을 일으킬 수 있다. 이 논문은 일반적인 트랜스펙트 시약을 사용하여 역경 질염 기술을 보고하여, 이는 트랜스펙트에 대한 실습 시간을 줄이고, 세포 생존에 영향을 미치지 않으며, 전기기보다 훨씬 저렴합니다. 이 프로토콜은 siRNA 및 마이크로 RNA 모방 (miR 모방) 및 항 miR와 같은 그밖 올리고뉴클레오티드의 질입에 완벽하게 적합합니다. 역형 형질 프로토콜의 원리는 세포 배양판에 복합체를 형성하기 위해 트랜스페트 시약및 올리고뉴클레오티드를 배양한 다음 성숙한 지방세포를 우물로 시드하는 것이다. 이어서, 송신세포는 올리고뉴클레오티드/트랜스페트 시약 복합체의 존재에서 부착판 표면에 재부착한다. 이 간단하고 효율적이며 저렴한 방법론은 지방 세포 기능에서 단백질 코딩 RNA 및 miRs의 역할과 비만 관련 질병에 대한 잠재적 역할에 대한 연구를 허용합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 논문은 성숙한 지방세포의 분화 및 트랜스포션을 위한 상세한 프로토콜을 제시합니다. 이러한 역형 형질 방법은 시나, 마이크로 RNA 모방, 항마이크로 RNA 모방, 항마이크로RNA 와 같은 올리고뉴클레오티드를 트랜스펙트하는 가장 어려운 세포주 중 하나인 3T3-L1 아디포사이클로 전환하는 간단하고 경제적이며 매우 효율적인 방법입니다. 이 메서드에는 고려해야 할 몇 가지 제한 사항이 있습니다. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 INSERM, 유니버시테 코트 다쥐르, 프랑스 국립 연구기관(ANR)이 향후 우수 연구소(Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01)와 우수 이니셔티브(Idexex UCAJEDI ANR-15-IDEX)를 통해 지원되었습니다. J.J.는 소시에테 프랑코폰 뒤 디아베테(SFD), 협회 프랑수아즈 데 에뛰드 에 드 레베시테(AFERO), 인스티투트 테마티크 멀티 유기체 테크놀로지스 부어 라 산테(ITMO), 벤자민-데레서트의 보조금으로 지원된다. J.G.는 ANR-18-CE14-0035-01에 의해 지원됩니다. J-F.T.는 ANR 보조금 ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01및 퐁당 부어 라 레체르체 메디칼 (Equipe FRM, DEQ20180839587)에 의해 지원됩니다. 또한 GIS IBISA 현미경 검사법과 이미징 플랫폼 코트 다쥐르(MICA)가 지원하는 콘세일 데파르테멘탈 데 알프스-마리타임스와 레지온 PACA가 지원하는 C3M의 이미징 코어 시설에 도 감사합니다.
Materials
| 12 well Tissue Culture Plate | Dutscher | 353043 | |
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090-046 | diluted to 5x with D-PBS |
| 2-Propanol | Sigma | I9516 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Accell Non-targeting Pool | Horizon Discovery | D-001910-10-05 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Collagen type I from calf skin | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| D-PBS | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagles's Medium (DMEM) | Gibco | 41965062 | 4.5 g/L D-Glucose; L-Glutamine; no Pyruvate |
| Ethanol | Sigma | 51976 | |
| FAM-labeled Negative Control si-RNA | Invitrogen | AM4620 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| Free Glycerol Reagent | Sigma-Aldrich | F6428 | |
| Glycerol Standard Solution | Sigma-Aldrich | G7793 | |
| HSP90 antibody | Santa Cruz | sc-131119 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Improved Minimal Essential Medium (Opti-MEM) | Gibco | 31985-047 | |
| Insulin, Human Recombinant | Gibco | 12585-014 | |
| miRIDIAN micro-RNA mimics | Horizon Discovery | ||
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| miScript II RT Kit | Qiagen | 218161 | |
| miScript Primer Assays Hs_RNU6-2_11 | Qiagen | MS00033740 | |
| miScript Primer Assays Mm_miR-34a_1 | Qiagen | MS00001428 | |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 219073 | |
| Newborn Calf Serum | Gibco | 16010-159 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool | Horizon Discovery | L-056623-01-0005 | |
| Penicillin and Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Perilipin-1 antibody | Cell Signaling | 3470 | Dilution : 1/1000 |
| Petri dish 100 mm x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
| PKB antibody | Cell Signaling | 9272 | Dilution : 1/1000 |
| PKB Phospho Thr308 antibody | Cell Signaling | 9275 | Dilution : 1/1000 |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Transfection reagent (INTERFERin) | Polyplus | 409-10 | |
| α-tubulin antibody | Sigma aldrich | T6199 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Vamp2 antibody | R&D Systems | MAB5136 | Dilution : 0.1 µg/mL |
References
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