Um modelo de cultura celular adipócito para estudar o impacto da modulação de proteína e micro-RNA na função adipócito
Summary
Apresentado aqui é um protocolo para fornecer oligonucleotídeos como RNA de pequena interferência (siRNA), imitações de micro-RNA (miRs) ou anti-micro-RNA (anti-miR) em adipócitos maduros para modular proteína e expressão micro-RNA.
Abstract
A alteração da função adipócito contribui para a patogênese de doenças metabólicas, incluindo diabetes tipo 2 e resistência à insulina. Isso destaca a necessidade de entender melhor o mecanismo molecular envolvido na disfunção adipócito para desenvolver novas terapias contra doenças relacionadas à obesidade. A modulação da expressão de proteínas e micro-RNAs em adipócitos continua sendo altamente desafiadora. Este artigo descreve um protocolo para diferenciar os fibroblastos murinos em adipócitos maduros e modular a expressão de proteínas e micro-RNAs em adipócitos maduros através de transfecção reversa usando RNA de pequena interferência (siRNA) e micro-RNA imitando (miR imitar) oligonucleotídeos. Este protocolo de transfecção reversa envolve a incubação do reagente transfeccionado e dos oligonucleotídeos para formar um complexo na placa de cultura celular à qual os adipócitos maduros são adicionados. Os adipócitos são então autorizados a recolocar à superfície da placa aderente na presença do complexo de reagentes oligonucleotídeos/transfecção. Análises funcionais como o estudo da sinalização de insulina, captação de glicose, lipogênese e lipólise podem ser realizadas nos adipócitos maduros 3T3-L1 transfetípidos para estudar o impacto da manipulação de proteínas ou micro-RNA na função adipócito.
Introduction
A obesidade é considerada um dos principais fatores de risco para inúmeras doenças metabólicas, incluindo resistência à insulina (IR), Diabetes Tipo 2 (T2D) e doenças cardiovasculares1. As terapias atuais não conseguiram parar o constante aumento da prevalência dessas doenças, e o manejo do IR de pacientes obesos e diabéticos continua sendo uma questão clínica importante. O tecido adiposo desempenha um papel crucial no controle da homeostase energética, e sua expansão patológica durante a obesidade contribui para o desenvolvimento de IR e T2D2,3. Isso destaca a necessidade de entender melhor o mecanismo molecular envolvido na disfunção adipócito para desenvolver novas terapias contra doenças relacionadas à obesidade. Muitos estudos têm investigado o papel das RNAs de codificação de proteínas na fisiologia adipócito e sua associação com a obesidade.
Mais recentemente, a descoberta de RNAs não codificadas (NCRNAs), especialmente micro-RNAs (miRs), forjou novos conceitos relacionados ao mecanismo de regulação de programas de expressão genética. Estudos têm demonstrado que as NCRNAs são importantes reguladores da função adipócito, e que sua desregulação desempenha um papel importante nas doenças metabólicas4. Assim, a manipulação de proteínas e ncRNAs em adipócitos é crucial para decifrar seus papéis na função adipócito e seu impacto em patologias como o T2D. No entanto, manipular a expressão de proteínas e ncRNAs in vivo, bem como em adipócitos primários permanece altamente desafiador, favorecendo o uso de modelos in vitro adipócitos.
Os fibroblastos murine 3T3-L1 se diferenciam facilmente em adipócitos maduros, funcionais e responsivos à insulina, que são uma linha celular bem caracterizada usada para estudar a função adipócito (por exemplo, sinalização de insulina, captação de glicose, lipólise e secreção de adipokines)5,6,7,8,9,10. Essas propriedades tornam os adipócitos 3T3-L1 um modelo atraente para modular a expressão de codificação de proteínas e nc-RNAs para decifrar seu papel na função adipócite e seu potencial papel em doenças relacionadas à obesidade. Infelizmente, enquanto os fibroblastos 3T3-L1 são fáceis de transfetar usando reagentes disponíveis comercialmente, adipócitos 3T3-L1 diferenciados são uma das linhas celulares mais difíceis de transfectar. É por isso que inúmeros estudos que manipulam a expressão genética em células 3T3-L1 têm focado na diferenciação de adipócitos em vez da função adipócito.
Por muito tempo, a única técnica eficiente para transfetálces foi a eletroporação5, que é tediosa, cara, e pode causar danos celulares. Este artigo relata uma técnica de transfecção reversa usando um reagente de transfecção comum, que reduz o tempo prático para transfecção, não tem efeito sobre a viabilidade celular, e é muito menos caro do que a eletroporação. Este protocolo é perfeitamente adequado para a transfecção de siRNA e outros oligonucleotídeos, como mímicas micro-RNA (miR mimics) e anti-miRs. O princípio do protocolo de transfecção reversa é incubar o reagente de transfecção e os oligonucleotídeos para formar um complexo na placa de cultura celular e, em seguida, semear os adipócitos maduros nos poços. Em seguida, os adipócitos se recolocarão à superfície da placa aderente na presença do complexo de reagentes oligonucleotídeos/transfecção. Essa metodologia simples, eficiente e barata permite o estudo do papel das RNAs e miRs de codificação proteica na função adipócito e seu potencial papel em doenças relacionadas à obesidade.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este artigo apresenta um protocolo detalhado para a diferenciação e transfecção de adipócitos maduros. Este método de transfecção reversa é um método simples, econômico e altamente eficiente para transfetar oligonucleotídeos como, mas não se limitando a, siRNAs, imitações de micro-RNA e anti-micro-RNAs em adipócitos 3T3-L1, que é uma das linhas celulares mais difíceis de transfeito. Este método tem algumas limitações que precisam ser consideradas. Este protocolo não é eficiente para transfecção c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho contou com o apoio do INSERM, da Université Côte d’Azur e da Agência Nacional de Pesquisa francesa (ANR) por meio do programa Investimentos para o futuro Laboratório de Excelência (Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01) e Iniciativa de Excelência (Idex UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001). J.J. é apoiado por subsídios da Société Francophone du Diabète (SFD), da Associação Francesaise d’Etude et de Recherche sur l’Obésité (AFERO), do Institut Thématique Multi-Organismes Technologies pour la Santé (ITMO) e da Fondation Benjamin-Delessert. J.G. é suportado pelo ANR-18-CE14-0035-01. A J-F.T. é apoiada pela anr grant ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01 e uma subvenção da Fondation pour la Recherche Médicale (Equipe FRM, DEQ20180839587). Agradecemos também a Instalação núcleo de imagem do C3M financiada pelo Conseil Départemental des Alpes-Maritimes e pelo Région PACA, que também conta com o apoio da Plataforma de Microscopia e Imagem GIS IBiSA Côte d’Azur (MICA).
Materials
| 12 well Tissue Culture Plate | Dutscher | 353043 | |
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090-046 | diluted to 5x with D-PBS |
| 2-Propanol | Sigma | I9516 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Accell Non-targeting Pool | Horizon Discovery | D-001910-10-05 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Collagen type I from calf skin | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| D-PBS | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagles's Medium (DMEM) | Gibco | 41965062 | 4.5 g/L D-Glucose; L-Glutamine; no Pyruvate |
| Ethanol | Sigma | 51976 | |
| FAM-labeled Negative Control si-RNA | Invitrogen | AM4620 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| Free Glycerol Reagent | Sigma-Aldrich | F6428 | |
| Glycerol Standard Solution | Sigma-Aldrich | G7793 | |
| HSP90 antibody | Santa Cruz | sc-131119 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Improved Minimal Essential Medium (Opti-MEM) | Gibco | 31985-047 | |
| Insulin, Human Recombinant | Gibco | 12585-014 | |
| miRIDIAN micro-RNA mimics | Horizon Discovery | ||
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| miScript II RT Kit | Qiagen | 218161 | |
| miScript Primer Assays Hs_RNU6-2_11 | Qiagen | MS00033740 | |
| miScript Primer Assays Mm_miR-34a_1 | Qiagen | MS00001428 | |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 219073 | |
| Newborn Calf Serum | Gibco | 16010-159 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool | Horizon Discovery | L-056623-01-0005 | |
| Penicillin and Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Perilipin-1 antibody | Cell Signaling | 3470 | Dilution : 1/1000 |
| Petri dish 100 mm x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
| PKB antibody | Cell Signaling | 9272 | Dilution : 1/1000 |
| PKB Phospho Thr308 antibody | Cell Signaling | 9275 | Dilution : 1/1000 |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Transfection reagent (INTERFERin) | Polyplus | 409-10 | |
| α-tubulin antibody | Sigma aldrich | T6199 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Vamp2 antibody | R&D Systems | MAB5136 | Dilution : 0.1 µg/mL |
References
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