研究蛋白质和微RNA调制对脂肪细胞功能的影响的脂肪细胞培养模型
Summary
这里介绍的是一个协议，将小干扰RNA（siRNA）、微RNA模拟（miR）或抗微RNA（抗miR）等寡核苷酸输送到成熟的脂肪细胞中，以调节蛋白质和微RNA表达。
Abstract
脂肪细胞功能的改变有助于代谢疾病的发病机制，包括2型糖尿病和胰岛素抵抗。这突出表明需要更好地了解脂肪细胞功能障碍所涉及的分子机制，以开发针对肥胖相关疾病的新疗法。调节脂肪细胞 中 蛋白质和微RNA的表达仍然极具挑战性。本文描述了一种将肉质成成熟脂肪细胞的方案，并利用小干扰RNA（siRNA）和微型RNA模拟（miR模仿）寡核苷酸，通过反向转化调节成熟脂肪细胞中蛋白质和微RNA的表达。此反向转化协议涉及转染试剂和寡核苷酸的孵化，以形成细胞培养板中的复合物，并添加成熟腺细胞。然后，在存在寡核苷酸/转染试剂复合物的情况下，允许脂肪细胞重新连接到粘附板表面。可对转染的3T3-L1成熟脂肪细胞进行胰岛素信号、葡萄糖吸收、脂生成和脂质分析等功能分析，以研究蛋白质或微RNA操作对脂肪细胞功能的影响。
Introduction
肥胖被认为是许多代谢性疾病的主要危险因素，包括胰岛素抵抗（IR）、2型糖尿病（T2D）和心血管疾病1。目前的治疗方法未能阻止这些疾病的发病率持续上升，肥胖和糖尿病患者的IR管理仍然是一个重要的临床问题。脂肪组织在控制能量平衡方面起着至关重要的作用，其在肥胖期间的病理扩张有助于红外和T2D2、3的发展。这突出表明需要更好地了解脂肪细胞功能障碍所涉及的分子机制，以开发针对肥胖相关疾病的新疗法。许多研究已经调查了蛋白质编码RNA在脂肪细胞生理学中的作用及其与肥胖的关系。
最近，非编码RNA（ncRNA）的发现，特别是微RNA（miRs），已经锻造了与基因表达程序调控机制相关的新概念。研究表明，ncRNA是脂肪细胞功能的重要调节器，其调节不良在代谢疾病中起着重要作用。因此，蛋白和ncRNA在脂肪细胞中的操纵对于破译它们在脂肪细胞功能中的作用及其对T2D等病理学的影响至关重要。然而，操纵蛋白质和ncRNA在体内和原发性脂肪细胞中的表达仍然极具挑战性，有利于使用体外脂肪细胞模型。
Murine 3T3-L1 成纤维细胞很容易分化成成熟、功能和胰岛素响应的脂肪细胞，这是用于研究脂肪细胞功能（如胰岛素信号、葡萄糖吸收、脂解和脂肪素分泌）5、6、7、8、9、10的具有良好特征的细胞系。这些特性使3T3-L1脂肪细胞成为调节蛋白质编码和nc-RNA表达的有吸引力的模型，以破译它们在脂肪细胞功能中的作用及其在肥胖相关疾病中的潜在作用。不幸的是，虽然3T3-L1成纤维细胞很容易使用商用试剂进行转染，但差异化的3T3-L1脂肪细胞是最难转染的细胞系之一。这就是为什么许多操纵3T3-L1细胞基因表达的研究都集中在脂肪细胞分化上，而不是脂肪细胞功能上。
长期以来，唯一有效的转染脂肪细胞的技术是电聚变5，这是乏味的，昂贵的，并可能导致细胞损伤。本文使用一种常见的转染试剂报告了反向转染技术，它减少了实际转染时间，对细胞生存能力没有影响，而且比电透电便宜得多。此协议非常适合硅酸和其他寡核苷酸（如微RNA模拟（miR模仿）和反微核素的转化。反向转化协议的原则是孵化转染试剂和寡核苷酸，在细胞培养板中形成复合物，然后将成熟的脂肪细胞播种到井中。然后，在寡核苷酸/转染试剂复合物的存在下，脂肪细胞重新连接到粘附板表面。这种简单、高效和廉价的方法允许研究蛋白质编码RNA和miR在脂肪细胞功能中的作用及其在肥胖相关疾病中的潜在作用。
Protocol
Representative Results
Discussion
本文对成熟脂肪细胞的分化和转染提出了详细的协议。这种反向转染方法是一种简单、经济、高效的方法，可将寡核苷酸（如但不限于siRNA、微RNA模仿和抗微RNA）转化为3T3-L1脂肪细胞，这是最难转染的细胞系之一。此方法有一些需要考虑的限制。此协议对于质粒DNA的转染效率不高，这限制了该技术对功能收益研究的效用。虽然包括3T3-L1细胞系在内的紫外细胞系通常用于研究体外脂肪细胞功能，但?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了国家航空研究局、蔚蓝海岸大学和法国国家研究局（ANR）的支持，该计划旨在为未来的卓越实验室（Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01）和卓越倡议（Idex UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001）进行投资。J.J.得到法语国家协会、法语国家协会、法国多组织技术协会（非国大）和本杰明-德莱塞特基金会的赠款支持。J.G. 得到 ANR-18-CE14-0035-01 的支持。J-F.T. 得到ANR赠款ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01和梅迪卡莱基金会（埃基佩·弗鲁姆，DEQ20180839587）的赠款的支持。我们还感谢由阿尔卑斯-海洋部和Région PACA资助的C3M成像核心设施，该设施也得到了GIS IBISA显微镜和成像平台Céte d’Azur（MICA）的支持。
Materials
| 12 well Tissue Culture Plate | Dutscher | 353043 | |
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090-046 | diluted to 5x with D-PBS |
| 2-Propanol | Sigma | I9516 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Accell Non-targeting Pool | Horizon Discovery | D-001910-10-05 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Collagen type I from calf skin | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| D-PBS | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagles's Medium (DMEM) | Gibco | 41965062 | 4.5 g/L D-Glucose; L-Glutamine; no Pyruvate |
| Ethanol | Sigma | 51976 | |
| FAM-labeled Negative Control si-RNA | Invitrogen | AM4620 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| Free Glycerol Reagent | Sigma-Aldrich | F6428 | |
| Glycerol Standard Solution | Sigma-Aldrich | G7793 | |
| HSP90 antibody | Santa Cruz | sc-131119 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Improved Minimal Essential Medium (Opti-MEM) | Gibco | 31985-047 | |
| Insulin, Human Recombinant | Gibco | 12585-014 | |
| miRIDIAN micro-RNA mimics | Horizon Discovery | ||
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| miScript II RT Kit | Qiagen | 218161 | |
| miScript Primer Assays Hs_RNU6-2_11 | Qiagen | MS00033740 | |
| miScript Primer Assays Mm_miR-34a_1 | Qiagen | MS00001428 | |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 219073 | |
| Newborn Calf Serum | Gibco | 16010-159 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool | Horizon Discovery | L-056623-01-0005 | |
| Penicillin and Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Perilipin-1 antibody | Cell Signaling | 3470 | Dilution : 1/1000 |
| Petri dish 100 mm x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
| PKB antibody | Cell Signaling | 9272 | Dilution : 1/1000 |
| PKB Phospho Thr308 antibody | Cell Signaling | 9275 | Dilution : 1/1000 |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Transfection reagent (INTERFERin) | Polyplus | 409-10 | |
| α-tubulin antibody | Sigma aldrich | T6199 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Vamp2 antibody | R&D Systems | MAB5136 | Dilution : 0.1 µg/mL |
References
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