Summary
En este estudio, describimos el proceso de aislamiento de linfocitos T a partir de muestras frescas de válvulas aórticas calcificadas y los pasos analíticos de la clonación de células T para la caracterización de los subconjuntos de leucocitos adaptativos mediante el análisis de citometría de flujo.
Abstract
La enfermedad de la válvula aórtica calcificada (CAVD), un proceso de enfermedad activa que va desde el engrosamiento leve de la válvula hasta la calcificación grave, se asocia con una alta mortalidad, a pesar de las nuevas opciones terapéuticas como el reemplazo de la válvula aórtica transcatéter (TAVR).
Las vías completas que comienzan con la calcificación de la válvula y conducen a la estenosis aórtica grave permanecen solo parcialmente comprendidas. Al proporcionar una representación cercana de las células de la válvula aórtica in vivo, el ensayo de linfocitos T del tejido de la válvula estenótica podría ser una forma eficiente de aclarar su papel en el desarrollo de la calcificación. Después de la escisión quirúrgica, la muestra fresca de la válvula aórtica se disecciona en pequeños trozos y los linfocitos T se cultivan, se clonan y luego se analizan mediante la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS).
El procedimiento de tinción es simple y los tubos teñidos también se pueden fijar con 0,5% de paraformaldehído y analizarse hasta 15 días después. Los resultados generados a partir del panel de tinción se pueden utilizar para rastrear los cambios en las concentraciones de células T a lo largo del tiempo en relación con la intervención y podrían desarrollarse fácilmente para evaluar los estados de activación de subtipos específicos de células T de interés. En este estudio, mostramos el aislamiento de células T, realizado en muestras frescas de válvula aórtica calcificada y los pasos para analizar clones de células T utilizando citometría de flujo para comprender mejor el papel de la inmunidad adaptativa en la fisiopatología CAVD.
Introduction
La enfermedad de la válvula aórtica calcificada (CAVD) es uno de los trastornos de las válvulas cardíacas más comunes, con un gran impacto en la atención médica. La frecuencia de reemplazo de la válvula aórtica en los últimos años ha aumentado dramáticamente y se espera que aumente aún más, debido a la creciente población de edad avanzada1.
La fisiopatología subyacente de la CAVD solo se conoce parcialmente y las estrategias terapéuticas actuales se limitan a medidas conservadoras o reemplazo de la válvula aórtica, ya sea a través de procedimientos quirúrgicos o percutáneos. Hasta la fecha, ningún tratamiento médico eficaz puede dificultar o revertir la progresión de la CAVD y la alta mortalidad se asocia con el inicio temprano de los síntomas, a menos que se realice el reemplazo de la válvula aórtica (RVA)2. En pacientes con estenosis aórtica sintomática grave, la supervivencia sin síntomas a 3 años se informó tan baja como 20%3. El reemplazo transcatéter de la válvula aórtica (TAVR) representa una nueva opción, revolucionando el tratamiento para pacientes de alto riesgo, especialmente entre los ancianos y ha reducido drásticamente la mortalidad, que era intrínsecamente alta en esta población4,5,6. A pesar de los prometedores resultados del TAVR, es necesaria más investigación para comprender la fisiopatología de la CAVD para identificar nuevas dianas terapéuticas tempranas7,8,9.
Anteriormente se pensaba que era un proceso pasivo y degenerativo, la CAVD ahora se reconoce como una enfermedad progresiva activa, caracterizada por un interruptor de fenotipo osteoblástico de las células intersticiales de la válvula aórtica10. Esta enfermedad implica mineralización progresiva, cambios fibrocalcificantes y reducción de la motilidad de las valvas de la válvula aórtica (esclerosis), que en última instancia obstruyen el flujo sanguíneo y conducen al estrechamiento (estenosis) de la abertura de la válvula aórtica11.
La inflamación se considera un proceso clave en la fisiopatología de la CAVD, similar al proceso de aterosclerosis vascular. La lesión endotelial permite la deposición y acumulación de especies lipídicas, especialmente lipoproteínas oxidadas en la válvula aórtica12. Estas lipoproteínas oxidadas provocan una respuesta inflamatoria, ya que son citotóxicas, con la actividad inflamatoria que conduce a la mineralización. Recientemente se ha destacado el papel de la inmunidad innata y adaptativa en el desarrollo de la CAVD y la progresión de la enfermedad13. Se ha documentado la activación y expansión clonal de subconjuntos específicos de células T de memoria en pacientes con CAVD y valvas de válvula aórtica mineralizadas, de modo que se supone que los procesos inflamatorios están involucrados al menos en el desarrollo de CAVD y presumiblemente también en la progresión de la enfermedad14. De hecho, aunque las células presentadoras de antígenos y los macrófagos están presentes tanto en la válvula sana como en la enferma, la presencia de linfocitos T es indicativa de una válvula aórtica envejecida y enferma. Este infiltrado linfocítico junto con un aumento de la neovascularización y la metaplasia son signos histológicos característicos de CAVD15.
Planteamos la hipótesis de la existencia de una interacción entre las células intersticiales de la válvula aórtica y la activación del sistema inmune, lo que potencialmente desencadena el inicio de un proceso inflamatorio crónico en la válvula aórtica. El ensayo de células T a partir del tejido de la válvula aórtica estenótica podría ser una forma eficiente de aclarar su papel en el desarrollo de la calcificación, ya que puede proporcionar una representación cercana de las células de la válvula aórtica in vivo. En el presente trabajo, utilizando tejido valvular aórtico, aislamos linfocitos T, los cultivamos y clonamos, y posteriormente los caracterizamos mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Se extirparon muestras frescas de válvula aórtica de pacientes con CAVD que recibieron reemplazo quirúrgico de la válvula para la estenosis aórtica grave. Después de la escisión quirúrgica, la muestra de válvula fresca se diseccionó en pequeños trozos y las células T se cultivaron, se clonaron y luego se analizaron mediante citometría de flujo. El procedimiento de tinción es simple y los tubos teñidos se pueden fijar con 0.5% de paraformaldehído y analizarse hasta 15 días después. Los datos generados a partir del panel de tinción se pueden utilizar para rastrear los cambios en la distribución de linfocitos T a lo largo del tiempo en relación con la intervención y podrían desarrollarse fácilmente para evaluar los estados de activación de subconjuntos específicos de células T de interés.
La extracción de tejido calcificado, el aislamiento de leucocitos del tejido calcificado y particularmente el uso de la citometría de flujo en este tipo de tejido puede ser un desafío, debido a problemas como la autofluorescencia. Existen pocas publicaciones con protocolos para este fin específico16,17,18. A continuación presentamos un protocolo diseñado específicamente para el aislamiento directo y el cultivo de linfocitos T a partir de muestras de válvula aórtica humana. La expansión clonal de los linfocitos es un sello distintivo de la inmunidad adaptativa. El estudio in vitro de este proceso proporciona información perspicaz sobre el nivel de heterogeneidad de los linfocitos19. Después de un período de incubación de tres semanas, los clones de células T están listos para ser explantados, ya que se obtuvo una cantidad adecuada de células T de cada clon, para permitir el estudio fenotípico y funcional. Posteriormente se estudia el fenotipo de los clones T mediante citofluorometría.
Este protocolo inmunológico es una adaptación de un método previamente desarrollado por Amedei et al. para el aislamiento y caracterización de células T a partir de tejido humano, especialmente diseñado para tejido humano calcificado, como en CAVD20,21,22. El protocolo aquí para el aislamiento de PBMC (células mononucleares de sangre periférica) utilizando una capa buffy irradiada describe una forma efectiva de obtener células alimentadoras (FC), específicamente ajustadas para la fase de clonación de linfocitos T aislados de células intersticiales valvulares. La capa alimentadora consiste en células detenidas por el crecimiento, que aún son viables y bioactivas. El papel de las células alimentadoras es importante para apoyar la supervivencia in vitro y el crecimiento de linfocitos T aislados de células intersticiales valvulares23. Para evitar la proliferación de células alimentadoras en cultivo, estas células deben someterse a una detención del crecimiento. Esto se puede lograr de dos maneras: a través de métodos físicos como la irradiación, o mediante el tratamiento con productos químicos citotóxicos, como la mitomicina C (MMC), un antibiótico antitumoral que se puede aplicar directamente a la superficie de cultivo24. Aquí mostramos la detención del crecimiento de las células alimentadoras lograda a través de la irradiación celular.
Este método presenta una forma eficiente y rentable de aislar y caracterizar las células T del tejido de la válvula aórtica, lo que contribuye a ampliar el espectro de métodos inmunológicos para explorar la fisiopatología de la CAVD.
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Protocol
El estudio se llevó a cabo de acuerdo con el Estatuto de la Charité para Garantizar las Buenas Prácticas Científicas y se respetaron las directrices y disposiciones legales sobre privacidad y ética. El Comité de Ética aprobó todos los experimentos en humanos y la privacidad y el anonimato de los pacientes se mantuvieron de acuerdo con las reglas informadas en el Formulario de Ética.
NOTA: Para el protocolo descrito a continuación se utilizaron muestras frescas de válvula estenótica humana.
1. Preparación de reactivos
- Preparar el medio completo RPMI enriquecido añadiendo RPMI 1640 Medio: Aminoácidos no esenciales; Piruvato de sodio, L-glutamina, ß-mercaptoetanol y penicilina-estreptomicina (pluma/estreptococo). Filtrarlo antes de usarlo. Conservar a +4 °C y utilizar en un plazo de dos meses.
- Preparar el medio de cultivo celular (CCM) para la fase de clonación utilizando el medio enriquecido RPMI 1640 completo añadido calor inactivado Fetal Bovine Serum (FBS), HB basal medium, 50 U de Interleucina 2 (IL-2) y Suero Humano (HS). Filtrar y usar dentro del día. No almacenar.
- Preparar el medio de cultivo celular para la fase de realimentación utilizando el medio completo RPMI 1640 enriquecido con FBS añadido, medio basal HB, 30 U de IL-2 y HS. Filtrar y usar dentro del día. No almacenar.
- Prepare el tampón de lavado que contiene 250 ml de RPMI y 5 ml de pluma/estreptococo. Conservar a +4 °C, utilizar en un plazo de dos meses.
2. Aislamiento y cultivo de linfocitos T humanos en matraces T-25
- Coloque la muestra de la válvula estenótica en una placa de Petri estéril llena de Wash Buffer, asegurándose de que toda la muestra de la válvula esté cubierta con ella. Dejar reposar durante 15 minutos.
- Cortar la válvula estenótica en trozos pequeños con un bisturí y dejar reposar de nuevo durante 10 minutos.
- Preparar el medio de cultivo celular con 50 U de IL-2, como se describió anteriormente, y filtrarlo.
- Agregue el CCM dentro de los matraces T25 y, con un alicate de plástico estéril, coloque las piezas de la válvula dentro de los matraces.
- Almacene los matraces en posición vertical dentro de una incubadora de CO2 durante una semana, teniendo cuidado de observar el estado del matraz bajo el microscopio. Los clones de células T deben ser visibles aproximadamente tres días después de la etapa de cultivo; para una mejor observación es recomendable colocar los matraces en posición horizontal durante 20 min antes del análisis microscópico.
NOTA: La cantidad de medio de cultivo celular depende de la cantidad de muestra presente y de cuántos matraces T25 se utilizarán. Teniendo en cuenta que cada pieza de válvula requiere 10 ml de CCM dentro de un matraz, 25 ml de CCM en un matraz T25 es apropiado para 3 piezas de válvula.
3. Fase de clonación
NOTA: Para la fase de clonación de células T, es necesario comenzar con el aislamiento de las células alimentadoras de una capa buffy irradiada (BC), siguiendo el protocolo PBMC.
- Abra la bolsa BC debajo de la campana de flujo laminar usando la espiga de la bolsa con válvula sin aguja y transfiera 50 ml de sangre en un matraz T150. Agregue 70 ml de PBS para diluir la sangre dentro del matraz.
- Tome cuatro tubos cónicos de 50 ml y coloque 20 ml de medio de gradiente de densidad en cada uno y coloque cuidadosamente 30 ml de sangre sobre él.
- Centrífuga durante 25 min a 800 x g y 20 °C con el freno apagado.
- Aspire cuidadosamente el sobrenadante y deséchelo como residuo. Recoja el anillo de PBMC en un nuevo tubo cónico de 50 ml agregando dentro de la solución de PBS hasta un volumen de 50 ml.
- Centrifugadora durante 10 min a 400 x g y 20 °C.
- Deseche el sobrenadante y suspenda el pellet añadiendo dentro de la solución de PBS hasta un volumen de 50 ml. Repetir la fase de centrifugación durante 10 min a 400 x g y 20 °C.
- Deseche el sobrenadante y suspenda los FC en 10 ml de medio de cultivo celular.
- Tome un nuevo tubo de recolección y diluya los FC con PBS 1:10 agregando dentro 9.9 ml de PBS y 100 μL del tubo con FC y medio de cultivo celular. Enjuague bien con una pipeta y tome 7 μL de esta dilución y cuente las células bajo el microscopio.
- Preparar el medio de cultivo celular para la fase de clonación: 70 mL con 50 U de IL-2, y luego dividirlo en dos tubos cónicos de 50 mL, cada tubo contendrá 25 mL de medio de cultivo celular, como se describe a continuación:
- Tubo 1: 25 mL de CCM + FCs + 0,6% de fitohemaglutinina (PHA)
- Tubo 2: 25 mL de CCM + linfocitos T
NOTA: El objetivo del método PMBCs es obtener 2 x 106 celdas por cada mL, por lo que los 25 mL de CCM preparados (Tubo 1) deben calcularse en consecuencia. La fórmula general utilizada es: Número de celdas contadas x 106: 1 mL = CCM x 106: X
4. Cultivo de linfocitos T en placas multipocillos
- Usando la pipeta electrónica, recoja todo el medio de cultivo celular dentro de los matraces y transfiéralo a un tubo cónico de 50 ml. Los frascos vacíos se pueden tirar.
- Pellet las células por centrifugación durante 10 min a 400 x g y 20 °C.
- Deseche el sobrenadante, suspenda el pellet en 50 mL de PBS y recoja las células por centrifugación durante 10 min a 400 x g y 20 °C. Repita este paso dos veces.
- Deseche el sobrenadante y suspenda el pellet en 1 ml de CCM. Tome 7 μL de esta dilución y cuente las células bajo el microscopio.
NOTA: El número de células contadas debe multiplicarse por el volumen de la cámara y por la dilución aplicada. - Proceder a diluir las células contadas de 105 a 103 en medio de cultivo celular y luego tomar 500 μL de 103 y ponerlo dentro del Tubo 2.
- Vierta el medio de cultivo celular de 25 ml del tubo 1 dentro de una placa de Petri de plástico de 100 mm x 15 mm.
- Tome cuatro placas multipocillo de fondo de 96 U y use una pipeta multicanal ajustada a FC de semillas de 100 μL en cada pozo.
- Tome el tubo 2 y vierta el medio de cultivo celular dentro de una placa de Petri. Usando una pipeta multicanal establecida a 100 μL, siembra células T en cada pozo.
- Guarde las placas multipozo dentro de una incubadora de CO2 durante una semana.
5. Primera fase de realimentación
- Usando una bolsa de recubrimiento buffy irradiado, siga el método pbMC para obtener FC como se describe en el método anterior.
- Preparar la cantidad adecuada de MCP sin PHA y filtrarla.
- Usando una pipeta multicanal, retire 100 μL de cada pozo, asegurándose de no tocar el fondo del pozo.
- Agregue 100 μL de FC en todos los pocillos como capa de alimentación para proporcionar nutrientes de cultivo celular y cambiar el medio.
NOTA: Para cada multipozo se aconseja considerar 6 mL de CCM, por lo que la cantidad recomendada para 4 multipocillos es de aproximadamente 30 mL. Pha (0,4% de la cantidad total de MCP) debe agregarse al MCP una vez cada dos semanas.
6. Segunda fase de realimentación
- Repita la fase de realimentación siguiendo el pasaje descrito anteriormente. Es necesario agregar 0.4% de PHA al medio de cultivo celular.
7. Primera fase de división de 1 pozo/muestra a 2 pocillos/muestra
- Verifique los cuatro multipocillos bajo el microscopio y continúe dividiendo esos pozos con clones de células T (TCC).
- Siga el protocolo pbmcs para aislar las células alimentadoras de una bolsa de buffy irradiada.
- Preparar el medio de cultivo celular con 30 U de IL-2. Agregue los FC y tome una nueva placa multipocillo de 96 pocillos con fondo en U.
- Usando una pipeta ajustada a 100 μL, enjuague bien dentro de los pocillos de las muestras seleccionadas y divida los 200 μL de volumen contenidos en cada pozo en 2 nuevos pozos de la nueva placa multipozo, con el fin de tener 100 μL de volumen para cada uno de los nuevos 2 pozos.
- Agregue 100 μL de FC dentro de todos los pozos nuevos. Cada pozo debe contener un volumen total de 200 μL.
- Coloque la pipeta a 100 μL y agregue 100 μL en dos pozos adicionales, que contengan solo FC para que sirvan como control.
NOTA: Utilice la microscopía de luz para observar todas las placas multipozo con el fin de determinar qué pozos han cultivado con éxito TCC. Para facilitar la selección de clones, se puede hacer una comparación con el control (los dos pozos que contienen solo FC), con el clon apareciendo más oscuro y más grande en comparación con el control. Los pocillos a seleccionar son aquellos con un clon grande, claro, redondo, con linfocitos densamente empaquetados. Si no hay TCC presentes después de dos semanas de realimentación, se recomienda esperar una semana más y realizar una fase de realimentación adicional.
8. Segunda fase de división de 2 pozos/muestra a 4 pozos/muestra
- Ajuste la pipeta a 100 μL, enjuague bien dentro de los dos pocillos de cada muestra y siembre dos nuevos pocillos de 100 μL para cada uno.
- Prepare el medio de cultivo celular con 30 U de IL-2 y siga la técnica de PBMC para extraer los FC de la bolsa de la capa buffy y colocar los FC dentro del CCM.
- Ajuste la pipeta a 100 μL y sembra los FC en todos los pozos. Almacene los multipocillos en una incubadora de CO2 durante una semana.
9. Tercera fase de división de 4 pozos/muestra a 8 pozos/muestra:
- Usando una pipeta multicanal establecida a 100 μL, enjuague bien dentro de los cuatro pocillos de cada muestra y siembre 100 μL en cada uno de los cuatro nuevos pozos en una nueva placa de 96 pocillos.
- Prepare el medio de cultivo celular y siga la técnica de PBMC para extraer los FC de una bolsa de capa de buffy irradiada.
- Coloque los FC dentro del MCP. Ajuste la pipeta a 100 μL y sembra los FC en todos los pozos. Almacene los multipocillos en una incubadora de CO2 durante una semana
10. Análisis citofluorimétrico
- Tome la placa multipocillo con la fecha más antigua de la incubadora de CO2 e identifique los tubos de recolección con los números de muestra a analizar.
- Usando una pipeta multicanal ajustada a 200 μL con 2 puntas, enjuague bien dentro de dos pocillos de la misma muestra y coloque ambos dentro del mismo tubo de recolección. Repita este paso para todas las muestras.
NOTA: Las muestras de FC no serán analizadas, ya que solo sirven como controles.
11. Preparación del panel de tinción de anticuerpos para el análisis citofluorimétrico
- Añadir 1 ml de solución de PBS para cada tubo y centrífuga durante 10 min a 400 x g y 20 °C.
- Después de la fase de centrifugación, deseche el sobrenadante.
NOTA: El panel de tinción de anticuerpos se puede encontrar en la Tabla 1. Cada concentración de anticuerpos individual calculada es de aproximadamente 2 μL/muestra. Se recomienda girar brevemente los tubos de anticuerpos antes de usar. Para proteger los anticuerpos conjugados con fluoróforos de la luz, todos los pasos deben realizarse en la oscuridad. - Prepare la mezcla de anticuerpos dentro de un tubo de 1,5 ml y vórtice.
- Agregue los anticuerpos dentro de las muestras y deje que las muestras se incuben en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 minutos.
- Añadir 1 ml de PBS en cada muestra y centrifugar durante 10 min a 400 x g y 20 °C.
- Deseche el sobrenadante y suspenda el pellet con 500 μL de solución de PBS.
- Proceder con el análisis citofluorimétrico (análisis FACS, Tabla 1).
NOTA: Las muestras teñidas se pueden fijar utilizando paraformaldehído al 0,5% (PFA) diluido en solución de PBS y analizado hasta 15 días después.
PRECAUCIÓN: El PFA es tóxico y debe manipularse con cuidado.
| Marcador | Fluoróforo |
| CD3 | PE/Cy7 |
| CD4 | Alexa Fluor 488 |
| CD8 | Violeta brillante 510 |
| CD14 | Violeta brillante 421 |
| CD25 | PEI |
| CD45 | Violeta brillante 711 |
Tabla 1. Panel de tinción de anticuerpos para detectar la población de linfocitos T en la enfermedad de la válvula aórtica por calcificación.
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Representative Results
Se utilizó un método simple y rentable para caracterizar la población leucocitaria de muestras frescas de válvula aórtica derivadas de pacientes humanos con estenosis grave de la válvula aórtica (consultar protocolo). El método para aislar los PBMC es un paso vital en la obtención de células alimentadoras, que se utilizan en cada paso del experimento (fases de clonación, realimentación y división) y permiten la detección y caracterización de leucocitos infiltrantes en muestras de válvula aórtica. Los pasos clave de este método se muestran en la Figura 1.
Figura 1. Aislamiento de FCs del pelaje buffy. (A) Sangre en capas sobre gradiente de densidad medio (B) Anillo de glóbulos blancos obtenido después de la centrifugación (C) Glóbulos blancos recolectados y resuspendidos en solución de PBS (D) Glóbulos blancos observados bajo microscopía de luz Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Después de dos semanas de incubación, clonamos y cultivamos con éxito una población de células T, como se muestra en la Figura 2.
Figura 2. Clon de células T después de dos semanas de incubación observado mediante microscopía de luz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La Figura 3 ilustra el esquema de cierre utilizado para el análisis de subpoblaciones de células T en pacientes con CAVD. Como se muestra en el resultado del análisis FACS, hay más células T CD4 + (43,032%) que células T CD8 + (1,079%).
Figura 3. Esquema de gating utilizado para el análisis de subpoblaciones de células T. (A) Se ha aplicado una compuerta para identificar la población específica de células T en una válvula estenótica. (B) Linfocitos CD14 negativos y linfocitos CD3 positivos. (C) Los linfocitos CD3 están cerrados para distinguir las células T CD4+ de las células T CD8+. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Para demostrar que los mismos marcadores de células T están presentes tanto en muestras de válvulas nativas como en muestras clonadas, realizamos análisis FACS sin la fase de clonación, como se ilustra en la Figura 4.
Figura 4. Resultados del análisis FACS de dos muestras de válvulas. Comparamos las células T obtenidas de una muestra de válvula nativa y una muestra clonada, validando que las células T encontradas en la válvula nativa comparten marcadores específicos de las células T en el producto final clonado. (A) Resultados FACS de una muestra de válvula nativa, sin la fase de clonación. B) Resultados FACS de la muestra de válvula analizada después de la fase de clonación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Todo el flujo de trabajo se resume en la Figura 5, a partir de la disección de la válvula aórtica humana y hasta el análisis FACS. Todos los pasos son necesarios para el análisis de una muestra de válvula aórtica. La fase 1 muestra el aislamiento de linfocitos del tejido de la válvula aórtica estenótica. Las muestras de la válvula deben cortarse y colocarse en una placa de Petri llena de tampón de lavado. Las piezas de la válvula se pueden colocar dentro de un matraz T25 lleno de CCM y almacenarse en una incubadora de CO2 durante una semana. La fase 2 muestra la fase de clonación, que consta de dos partes: 1) aislamiento de FC de la bolsa de recubrimiento buffy irradiado y 2) fase de clonación de células T y culmina con el cultivo celular en una placa multipozo de 96 pocillos, que se almacena en una incubadora de CO2 durante una semana. Las fases 3 y 4 consisten en la fase de realimentación utilizando FC de la capa buffy irradiada; esta fase debe repetirse durante dos semanas consecutivas. Las fases 4, 5 y 6 muestran la fase de división de los clones de células T; la primera fase de división es de 1 pozo/muestra a dos pozos por cada muestra en una nueva placa multipozo; la segunda división es de 2 pozos / muestra a 4 pozos para cada uno en la misma placa multipozo; la tercera y última fase de división es de 4 pozos/muestra a 8 en una nueva placa multipozo. La fase 7 es la fase final, donde las muestras se analizan mediante el análisis FACS.
Figura 5. FLUJO de trabajo experimental CAVD. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
A partir de los resultados preliminares (Figura 2) podemos concluir que los linfocitos, junto con los leucocitos CD45+ están presentes en las válvulas aórticas calcificadas, lo que indica que la enfermedad de la válvula aórtica calcificada está relacionada con la activación del sistema inmune y la actividad inflamatoria.
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Discussion
Aquí presentamos un método para caracterizar subpoblaciones de linfocitos T aisladas de muestras de válvula aórtica estenótica, utilizando citometría de flujo. Este método requiere el uso de una capa buffy irradiada para aislar los PBMC. La frecuencia de radiación a la que deben someterse las bolsas de buffy coat es de 9000 Rad/90 Gray (Gy) y representa un paso crucial para detener la proliferación de las células alimentadoras. El papel de las células aisladas de las bolsas de la capa buffy es actuar solo como células alimentadoras y proporcionar nutrientes para las células T aisladas de las válvulas. El uso de una bolsa de abrigo buffy sin irradiar promovería la proliferación de PBMC en el cultivo, como se ha observado en los últimos 25. Una frecuencia de radiación por debajo de 90 Gy mostró proliferación de PBMC en cultivo, por lo que recomendamos usar exactamente 90 Gy de radiación. Cabe destacar que es recomendable utilizar la capa buffy irradiada el mismo día o como máximo al día siguiente, manteniéndola en un dispositivo que la mantenga en constante agitación. Otro paso crucial de este método podría estar representado por la fase de clonación de linfocitos, que podría verse afectada por artefactos; para evitar este evento realizamos el FACS en muestras frescas de válvula aórtica. La fase de clonación de linfocitos T tiene la ventaja de obtener un mayor número de clones T (una media de 15 clones de linfocitos T por cada válvula) para ser analizados fenotípica y funcionalmente, que el número obtenido del análisis de una muestra fresca. La técnica de clonación ha sido utilizada por este grupo de investigación durante muchos años y dependiendo del tipo de tejido analizado, el perfil de linfocitos fue diferente21,26,27. El primer paso del método se refiere al aislamiento de células T de una válvula aórtica estenótica. Todos los pasos descritos deben realizarse bajo una campana de flujo laminar en condiciones estériles y se recomienda encarecidamente desinfectar todos los materiales antes de su uso. El tiempo requerido para obtener resultados fue de 6 semanas y el promedio de linfocitos T obtenidas de la fase de clonación fue de 20 x 106 células. La fase de monitoreo de las placas multipozo es muy importante y no debe pasarse por alto. Un cambio en el color del medio a amarillo podría representar una contaminación bacteriana, en cuyo caso todos los instrumentos utilizados deben ser esterilizados y las placas multipozo desechadas.
Antes del análisis FACS es importante establecer una puerta adecuada, para verificar que no haya una superposición específica entre los canales de anticuerpos. Esto permite la separación óptima entre las puertas positivas y negativas. Se recomienda el uso de los mismos lotes de anticuerpos para todas las muestras implicadas en el estudio para obtener un resultado homogéneo. También es necesario proteger los anticuerpos conjugados con fluoróforos de la luz, realizando todos los pasos con la luz apagada.
Este método es efectivo para producir resultados con alta reproducibilidad y no es costoso. Una limitación de este método es el pequeño tamaño de la muestra, debido a la disponibilidad limitada de las muestras de válvulas humanas, así como la falta de un grupo de control.
Los resultados preliminares apoyan el papel de la inmunidad adaptativa como un elemento crucial en el desarrollo y la progresión de la enfermedad de la válvula aórtica calcificada. Todos los pacientes inscritos en este estudio tenían un diagnóstico de estenosis aórtica calcifica sintomática grave, con una edad promedio de 70 años, en su mayoría hombres. La existencia de poblaciones de células T en las válvulas aórticas analizadas proporciona evidencia de la actividad inflamatoria de la válvula aórtica enferma como punto de control de activación de las células inmunes. Un punto de interés futuro podría ser analizar la funcionalidad de las células T infiltrantes de CAVD y caracterizar la especificidad de las células T como se informó anteriormente en enfermedades similares, como en la aterosclerosis28,29,30.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Todas las bolsas de buffy coat utilizadas para este protocolo fueron irradiadas gracias a la disponibilidad del Dr. Peter Rosenthal, el Dr. Dirk Böhmer y todo el equipo del Departamento de Radiología de Charité Benjamin Franklin. Becaria/Mary Roxana Christopher, este trabajo está respaldado por una beca de la Sociedad Alemana de Cardiología (DGK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL plastic syringes | Fisherbrand | 9000701 | |
| 96- well U- bottom Multiwell plates | Greiner Bio-One | 10638441 | |
| Bag Spike (needle free) | Sigma | P6148 | Dilute to 4% with PBS |
| CD14 Brilliant violet 421 | Biolegend | 560349 | |
| CD25 PE | Biolegend | 302621 | |
| CD3 PE/Cy7 | Biolegend | 300316 | |
| CD4 Alexa Fluor 488 | Biolegend | 317419 | |
| CD45 Brilliant violet 711 | Biolegend | 304137 | |
| CD8 Brilliant violet 510 | Biolegend | 301047 | |
| Eppendorf tube 1.5 mL | Eppendorf | 13094697 | |
| Eppendorf tube 0.5 mL | Thermo Scientific | AB0533 | |
| Falcon 15 mL conical centrifuge tube | Falcon | 10136120 | |
| Falcon 50 mL conical centrifuge tubes | Falcon | 10788561 | |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | BD | 2300E | |
| Fast read 102 plastic counting chamber | KOVA INTERNATIONAL | 630-1893 | |
| Filters for culture medium 250 mL | NalgeneThermo Fisher Scientific | 168-0045 | |
| Filters for culture medium 500 mL | NalgeneThermo Fisher Scientific | 166-0045 | |
| HB 101 Lyophilized Supplement | Irvine Scientific | T151 | |
| HB Basal Medium | Irvine Scientific | T000 | |
| Heat-Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum) | Euroclone | ECS0180L | |
| HS (Human serum) | Sigma Aldrich | H3667 | |
| Human IL-2 IS | Miltenyi Biotec | 130-097-744 | |
| L-Glutamine | Gibco | 11140050 | |
| Lymphoprep | Falcon | 352057 | |
| Non-essential amino acids solution | Sigma | 11082132001 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 10538931 | |
| PBS (Phosphate-buffered saline) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070063 | 10000 U/mL |
| PHA (phytohemagglutinin) | Stem Cell Technologies | 7811 | |
| Plastic Petri dishes | Thermo Scientific | R80115TS | 10 0mm x 15 mm |
| RPMI 1640 Media | HyClone | 15-040-CV | |
| Sodium pyruvate | Gibco by Life technologies | 11360070 | |
| Syringe Filters 0,45µl | Rotilabo-Spritzenfilter | P667.1 | |
| T-25 Cell culture flasks | InvitrogenThermo Fisher Scientific | AM9625 | |
| T-75 Cell culture flask | Thermo Fisher Scientific | 10232771 | |
| β- Mercaptoethanol | Gibco | A2916801 |
References
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