التقييم الوظيفي لحاجز الوصلة الضيق المعوي ونفاذية الأيونات في الأنسجة الأصلية باستخدام تقنية الغرفة
Summary
الظهارة المعوية لا تمنح امتصاص العناصر الغذائية فحسب ، بل الحماية من المواد الضارة. ينظم التقاطع بين الخلايا القمي الأكثر ظهارة ، أي التقاطع الضيق ، المذاب شبه الخلوي ونفاذية الأيونات. هنا ، يتم وصف بروتوكول لإعداد صفائح الغشاء المخاطي وتقييم انتقائية الأيونات للتقاطعات الضيقة باستخدام تقنية غرفة Ussing.
Abstract
تم اختراع تقنية غرفة Ussing لأول مرة من قبل العالم الدنماركي Hans Ussing في عام 1951 لدراسة النقل عبر الخلايا للصوديوم عبر جلد الضفادع. منذ ذلك الحين ، تم تطبيق هذه التقنية على العديد من الأنسجة المختلفة لدراسة المعلمات الفسيولوجية للنقل عبر الأغشية. طريقة غرفة Ussing أفضل من الطرق الأخرى لأنه يمكن استخدام الأنسجة الأصلية ، مما يجعلها أكثر قابلية للتطبيق على ما يحدث في الجسم الحي. ومع ذلك ، نظرا لاستخدام الأنسجة الأصلية ، فإن الإنتاجية منخفضة ، والوقت محدود ، ويتطلب إعداد الأنسجة مهارة وتدريبا. وقد استخدمت هذه الغرف لدراسة بروتينات ناقلة محددة في الأنسجة المختلفة ، وفهم الفيزيولوجيا المرضية للأمراض كما هو الحال في التليف الكيسي ، ودراسة نقل الأدوية وامتصاصها ، وساهمت بشكل خاص في فهم نقل المغذيات في الأمعاء. بالنظر إلى عملية النقل الظهاري الكاملة للنسيج ، ليس فقط المسارات عبر الظهارية ، ولكن أيضا المسارات شبه الخلوية مهمة. التقاطعات الضيقة هي المحدد الرئيسي لنفاذية الأنسجة شبه الخلوية المحددة عبر الأمعاء. في هذه المقالة ، سيتم استخدام تقنية غرفة Ussing لتقييم الانتقائية شبه الخلوية للأيونات عن طريق قياس التوصيل عبر الظهارة وإمكانات التخفيف.
Introduction
تم تطوير طريقة غرفة Ussing لأول مرة من قبل العالم الدنماركي هانز أوسينغ. استخدمه المستخدم لأول مرة لقياس تيار الدائرة القصيرة لنقل الصوديوم عبر جلد الضفدع بعد أن لوحظ أن كلوريد الصوديوم يمكن نقله عبر الجلد ضد تدرج تركيز حاد1. يتكون نظامه من جلد الضفدع المثبت بين غرفتين مع إمكانية الوصول إلى جانبي الجلد. احتوت كل غرفة على حل رينجر الذي تم تعميمه وتهويته. قام جسران ضيقان للرنين الضيق يقعان بالقرب من الجلد ومتصلين بأقطاب KCl-calomel المشبعة بقياس فرق الجهد كما يقرأه المقوي. تم وضع زوج ثان من جسور الرنين أجار في الطرف الآخر من كل غرفة متصلة بأكواب مع KCl مشبعة مشبعة ب AgCl لتطبيق قوة دافعة كهربائية توفرها البطارية. تم استخدام مقسم جهد لضبط الجهد بحيث يظل فرق الجهد عبر الجلد صفرا ، وبالتالي خلق ظروف ماس كهربائى. كما تم توصيل مقياس ميكروأمبير لقراءة التيار الذي يمر عبر الجلد (انظر الشكل الوارد في المرجع 1 للحصول على تصميم الغرفة الأصلي).
على مدى السنوات ال 70 الماضية ، تم تطبيق هذه التقنية على العديد من الأنسجة المختلفة ، وخاصة الأنسجة المعوية ، لدراسة نقل المغذيات والأيونات. على سبيل المثال ، تمت دراسة آلية الإسهال الناجم عن الكوليرا عن طريق تركيب دقاق الأرانب في هذه الغرف ، ووجد أن الإسهال الناجم عن سموم الكوليرا يتم بوساطة cAMP2. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام هذه الغرف أيضا لدراسة الآلية الكامنة وراء نقل الجلوكوز عبر الناقل المشترك Na + – Glucose 1 (SGLT1)3. يركز مختبرنا على النقل عبر الخلايا وشبه الخلوية في الخلايا الظهارية المعوية. باستخدام طريقة غرفة Ussing ، تم تقييم نقل الببتيد في Claudin 15 من الفئران بالضربة القاضية ، والتي أضعفت نقل الصوديوم شبه الخلوي ، باستخدام غرف Ussing لقياس امتصاص ثنائي الببتيد glycylsarcosine غير القابل للتحلل. وقد وجد أن التوازن المضيء Na+ مهم لنقل الببتيد المقترن بالبروتون4. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام هذه الغرف أيضا للتحقيق في إفراز الأنيون في أعور الفئران استجابة للتنشيط تحت المخاطي لمستقبل تنشيط البروتين المنشط 1 بواسطة التربسين البروتياز البروتيني سيرين 5.
كما تم مؤخرا استخدام غرف الاستخدام لتقييم المسارات شبه الخلوية في الأنسجة الظهارية. يتم تنظيم المسارات شبه الخلوية بواسطة تقاطعات ضيقة ، وهي عبارة عن مجمعات من البروتينات التي تتشكل عند النقطة التي تلتقي فيها خليتان أو أكثر 6. يتم تحديد وظيفة الحاجز والانتقائية الأيونية (سواء كانت الأنيونات أو الكاتيونات قادرة بشكل انتقائي على المرور عبر التقاطع الضيق) من خلال وجود بروتينات عائلة كلودين. بعضها بمثابة حواجز (كلودين 3 و 7) ، مسام أنيون (كلودين 10 أ) ، أو مسام كاتيون (كلودين 2 و 10 ب و 15)7. وقد استخدمت طرق أخرى لتقييم المسار شبه الخلوي، مثل الانحراف الفموي ل FITC مصحوبا بتركيز FITC في بلازما الدم8، أو EDTA-Cr9؛ ومع ذلك ، فإن هذه التقنيات ذات دقة أقل ولا يمكنها تقييم انتقائية الأيونات أو قسم معين من أقسام الأمعاء. ومع ذلك ، يمكن استخدام غرف الاستخدام لتقييم إمكانات التخفيف للأيونات المستهدفة ، وبالتالي تحديد انتقائية الأيونات للتقاطعات الضيقة. على سبيل المثال ، مع كلوريد الصوديوم ، يمكن حساب انتقائية التقاطعات الضيقة ل Na + و Cl– عن طريق تخفيف جانب واحد من الغشاء (عادة الجانب المخاطي) وقياس التغير في فرق الجهد عبر الظهارة. يمكن تقدير النفاذية النسبية ل Na+ و Cl- بواسطة معادلة Goldman-Hodgkin-Katz10 ويمكن تقدير انتقائية التقاطع الضيق باستخدام معادلة Kimizuka-Koketsu 11. وبالتالي ، تتمتع هذه الغرف بميزة قياس المعلمات الكهروفسيولوجية للأنسجة ، ونتيجة لذلك توفر المزيد من المعلومات حول مرور الأيونات عبر التقاطعات الضيقة أكثر من الطرق الأخرى الأقل دقة.
لا تقتصر طريقة غرفة Ussing على الأمعاء فحسب ، على الرغم من أنها تستخدم على نطاق واسع في الدراسات المتعلقة بالأمعاء ، إلا أن لها العديد من التطبيقات الأخرى أيضا. على سبيل المثال ، تم استخدام هذه الغرف لدراسة التليف الكيسي ، وعلى وجه التحديد منظم التوصيل عبر الغشاء عبر الغشاء لقناة الكلوريد (CFTR)12. يحدث التليف الكيسي بسبب طفرة في CFTR13 ، مما يؤدي إلى ضعف إفراز الكلوريد ونقل السوائل بواسطة الخلايا الظهارية التنفسية ، وما ينتج عن ذلك من طبقة مخاطية أكثر سمكا وجفافا14. تم إجراء دراسة CFTR الظهارية في مجرى الهواء مع هذه الغرف ليس فقط لفهم المرض ، ولكن لاكتشاف طرق لعلاج المرض. على سبيل المثال، في المرضى الذين يعانون من طفرات نادرة تسبب التليف الكيسي، تم استخدام تحليل الخلايا الظهارية التنفسية للمريض لاختبار العلاجات مثل Orkambi والعلاج المشترك مكبر للصوت15.
كما تم استخدام غرف لدراسة طرق توصيل الأدوية، مثل أنسجة الخزعة البشرية لدراسة امتصاص الأدوية والحرائك الدوائية16. امتصاص الأمعاء ليس هو الطريق الوحيد لتوصيل الدواء. كما استخدمت هذه الغرف لدراسة أنظمة توصيل الأدوية الأنفية17. كما تم إجراء دراسات توصيل الدواء مع غرف Ussing للعين. في قرنية الأرانب ، أجريت دراسات النفاذية والامتصاص مع Labrasol ، وهو دواء مصمم لزيادة امتصاص الأدوية عبر الأنسجة 18. فحصت دراسة أخرى تأثير كلوريد البنزيلالكونيوم على توصيل الدواء عبر الصلبة في صلب الأرنب 19.
طريقة غرفة الاستخدام مفيدة لأنه يمكن استخدام الأنسجة الأصلية. على هذا النحو ، فمن الأفضل على النماذج في المختبر مثل خطوط الخلايا Caco-2. ومع ذلك ، تتطلب هذه التقنية مهارة ووقتا لإعداد العينات ، لذلك فهي ليست مناسبة للتطبيقات عالية الإنتاجية. يمكن دراسة الخصائص الكهروفسيولوجية للطبقات الأحادية للخلية باستخدام إدراج زراعة الخلايا في هذه الغرف. وقد سمحت الاكتشافات الحديثة بزراعة المواد العضوية وهي أعضاء صغيرة تزرع في الثقافة من حصاد الخلايا الجذعية الظهارية أو البطانية20. يمكن التلاعب بالثقافة العضوية لزراعتها في طبقة أحادية ، مما يجعل من الممكن تركيب المواد العضوية في غرفة Ussing 21. يمكن دراسة المواد العضوية لمختلف الأنسجة الظهارية والبطانية ، مما يقلل من عدد الحيوانات المطلوبة ، حيث يمكن الحفاظ على الثقافة العضوية على المدى الطويل. سيؤدي ذلك أيضا إلى زيادة الإنتاجية نظرا لعدم الحاجة إلى خطوات تشريح الأنسجة وإعدادها المستهلكة للوقت والشاقة. في المستقبل ، ستظل دراسات غرفة Ussing مفيدة جدا لدراسة نقل الأنسجة وستكون مهمة بشكل خاص في مجال الطب الشخصي.
يوضح البروتوكول التالي تطبيق طريقة غرفة Ussing لتقييم وظيفة الانتقائية والحاجز للتقاطعات الضيقة في الأمعاء الدقيقة لفئران Claudin 15 بالضربة القاضية (Cldn15-/-) وضوابط النوع البري (WT) عن طريق قياس إمكانات التخفيف من كلوريد الصوديوم. تتشكل التقاطعات الضيقة (TJ) عند النقطة التي تلتقي فيها خليتان أو أكثر في الأنسجة الظهارية والبطانية. يعتقد أن التقاطعات الضيقة ثنائية الخلية (bTJ) ، وخاصة بروتينات عائلة كلودين الموجودة داخل bTJ ، تحدد وظيفة الحاجز واستمرارية TJ7. Cldn15-/- الفئران لديها الأمعاء الدقيقة الضخمة22 وانخفاض القدرة على امتصاص المغذيات بسبب فقدان إعادة تدوير Na+ المعوية التي تحدث عن طريق كلودين 154،23،24. لقد أضعفت الفئران Cldn15-/- الفئران توازن Na + ، مما يجعلها نموذجا مثيرا للاهتمام لدراسة الانتقائية الدائمة ل TJ. يقيم البروتوكول التالي نفاذية TJ إلى كلوريد الصوديوم عن طريق قياس إمكانات التخفيف من كلوريد الصوديوم (PNa / PCl) في الأمعاء الدقيقة الوسطى. باختصار ، يمكن استخدام التغير في فرق جهد الغشاء الذي يحدث عن طريق تخفيف جانب واحد من الغشاء (الجانب M أو الجانب S ، وكلاهما يقاس في البروتوكول أدناه) لحساب نفاذية Na + (PNa) و Cl– (PCl) ، وسيظهر جهد التخفيف (PNa / PCl) ما إذا كان التقاطع الضيق له انتقائية كاتيونية أو أنيونية.
أجريت التجارب في هذا البروتوكول باستخدام غرفة Ussing مخصصة (الشكل 1A) ، والتي تتكون من نصفين ، يتم تركيب المستحضر المعوي بينهما عموديا ، ومكبر صوت مشبك الجهد ، والمسجل الكهربائي ، والأقطاب الكهربائية ، والجسور الملحية ، ومحلول Ringer ، ومخزن HEPES المؤقت (150 mM NaCl) ، والمخزن المؤقت HEPES المخفف (75 mM NaCl) ، والتحضير المعوي (للحصول على تفاصيل حول المعدات انظر جدول المواد).
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه التجربة ، تم استخدام غرف Ussing لقياس المعلمات الكهربائية الأساسية وإمكانات التخفيف من كلوريد الصوديوم في الأمعاء الدقيقة لفئران Cldn15-/- و WT. من المهم جدا عند إجراء تجارب غرفة Ussing التحقق من أن إعداد الغشاء المستخدم في التجارب قابل للتطبيق. وعادة ما يتم ذلك عن طريق إضافة الجلوك…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم دعم هذا العمل بواسطة 17K00860 (إلى HH) و 19K20152 (إلى NI). تود WH أن تعرب عن تقديرها لمؤسسة Otsuka Toshimi للمنح الدراسية لدعمها المالي من 2018-2021.
Materials
| #3 polyethyl tubing | Hibiki | outer diameter 1.0 mm; inner diameter 0.5 mm | |
| #7 polyethyl tubing | Hibiki | outer diameter 2.3 mm; inner diameter 1.3 mm | |
| 10 mL locking syringe | Terumo | SS-10LZ | Locking syringes are necessary to prevent the needle from dislodging during filling |
| 19 g needle | Terumo | NN-1938R | Please use caution when working with needles and dispose of in sharps container |
| 23 g needle | Terumo | NN-2332R | Please use caution when working with needles and dispose of in sharps container |
| 5 mm punch | NA | NA | Use to punch holes in filter paper and parafilm |
| acupuncture needles | Seirin | NS | Used as dissection pins to pin tissue to dissection plate |
| Agar | Fujifilm Wako | 010-15815 | |
| Alligator clips | NA | NA | Connects the electrode to the amplifier |
| CaCl2 | Fujifilm Wako | 038-00445 | |
| D(-)-Mannitol | Fujifilm Wako | 133-00845 | This is used to correct for the osmolality difference in dilution HEPES buffer |
| D(+)-Glucose | Fujifilm Wako | 049-31165 | |
| Dissection kit | You will need, scissors and curved forceps | ||
| Dissection plates | We used 10 cm cell culture plates and covered with silicon rubber | ||
| DMSO | Sigma | 472301-500ML | For making forskolin stock |
| Electrical recorder | TOA Electronics | PRR-5041 | Other equivalent electrical recorders are available commercially |
| Epithelial voltage clamp amplifier | Nihon Kohden | CEZ9100 | Other equivalent amplifiers are available commerically |
| filter paper, cut into squares | NA | NA | Punched with a 5 mm punch, used to hold intestinal preparation |
| fine forceps | Fast Gene | FG-B50476 | For blunt dissection of the muscle layer |
| Forskolin | Alomone Labs | F-500 | Make 10 mM stock in DMSO, final concentration will be 10 µM |
| HEPES | Sigma | H4034-1KG | |
| Indomethacin | Sigma | I7338-5G | Make a 1 mM stock in 21 mM NaHCO3, final concentration is 10 µM |
| K2HPO4 | Fujifilm Wako | 164-04295 | |
| KCl | Fujifilm Wako | 163-03545 | |
| KCl/calomel electrode | Asch Japan Co. | SCE-100 | |
| KH2PO4 | Kanto chemical | 32379-00 | |
| L(+)-Glutamine | Fujifilm Wako | 074-00522 | |
| MgCl2 | Fujifilm Wako | 135-00165 | |
| Mixed Gas (95% O2/5% CO2) | Shizuoka Oxygen Company | Used for bubbling Ringer solution and chambers when using Ringer solution | |
| NaCl | Fujifilm Wako | 191-01665 | |
| NaCl electrode | NA | NA | Handmade electrodes which require concentrated NaCl and Silver wire |
| NaHCO3 | Fujifilm Wako | 191-01305 | |
| O2 Gas | Shizuoka Oxygen Company | Used for bubbling chambers when using HEPES buffer | |
| parafilm | Bemis | PM-996 | Used to help seal Ussing chambers |
| pH meter | DKK-TOA Corp | HM-305 | HEPES buffer needs to be adjusted to pH 7.4 at 37 °C |
| pH meter electrode | DKK-TOA Corp | GST-5311C | |
| silicone rubber | Shinetsu Chemical | KE-12 | Used to fill dissection plates |
| silver wire | Used for making NaCl electrodes | ||
| Small jars w/ plastic lids | NA | NA | Use for NaCl electrodes |
| stereomicroscope | Zeiss | Stemi 305 | A stereomicroscope allows you to see depth, so you can dissect the tissue more easily |
| Tris (Trizma base) | Sigma | T1503-1KG | Make a 1M solution to adjust pH of HEPES buffers |
| Ussing chambers | Sanki Kagaku Kougei | These chambers are custom made continuous perfusion Ussing chambers with a window diameter of 5 mm | |
| Water pump and heating system | Tokyo Rikakikai Co. Ltd. | NTT-110 |
References
- Ussing, H. H., Zerahn, K. Active transport of sodium as the source of electric current in the short-circuited isolated frog skin. Acta Physiologica Scandinavica. 23, 110-127 (1951).
- Field, M. Ion transport in rabbit ileal mucosa. II. Effects of cyclic 3′, 5′-AMP. American Journal of Physiology – Legacy Content. 221, 992-997 (1971).
- Herrmann, J. R., Turner, J. R. Beyond Ussing’s chambers: contemporary thoughts on integration of transepithelial transport. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 310, 423-431 (2015).
- Ishizuka, N., et al. Luminal Na + homeostasis has an important role in intestinal peptide absorption in vivo. American Journal of Physiology – Gastorintestinal and Liver Physiology. 315, 799-809 (2018).
- Ikehara, O., et al. Subepithelial trypsin induces enteric nerve-mediated anion secretion by activating proteinase-activated receptor 1 in the mouse cecum. Journal of Physiological Sciences. 62, 211-219 (2012).
- Furuse, M. Molecular basis of the core structure of tight junctions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 002907 (2010).
- Tsukita, S., Tanaka, H., Tamura, A. The claudins: From tight junctions to biological systems. Trends in Biochemical Sciences. 44, 141-152 (2019).
- Li, B. R., et al. In vitro and in vivo approaches to determine intestinal epithelial cell permeability. Journal of Visual Experiments: JoVE. , e57032 (2018).
- Schoultz, I., Keita, &. #. 1. 9. 7. ;. V. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9, (2020).
- Yu, A. S. L., et al. Molecular basis for cation selectivity in claudin-2-based paracellular pores: Identifi cation of an electrostatic interaction site. Journal of General Physiology. 133, 111-127 (2009).
- Kimizuka, H., Koketsu, K. Ion transport through cell membrane. Journal of Theoretical Biology. 6, 290-305 (1964).
- Li, H., Sheppard, D. N., Hug, M. J. Transepithelial electrical measurements with the Ussing chamber. Journal of Cystic Fibrosis. 3, 123-126 (2004).
- Riordan, J. R., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: Cloning and characterization of complementary DNA. Science. 245, 1066-1073 (1989).
- Smith, J. J., Karp, P. H., Welsh, M. J. Defective fluid transport by cystic fibrosis airway epithelia. Journal of Clinical Investigation. 93, 1307-1311 (1994).
- Molinski, S. V., et al. Orkambi and amplifier co-therapy improves function from a rare CFTR mutation in gene-edited cells and patient tissue. EMBO Molecular Medicine. 9, 1224-1243 (2017).
- Kisser, B., et al. The Ussing chamber assay to study drug metabolism and transport in the human intestine. Current Protocols in Pharmacology. 77, 1-19 (2017).
- Östh, K. . The horizontal Ussing chamber method in studies of nasal drug delivery – Method Delopment and Applications Using Different Formulations. , (2002).
- Guo, P., et al. Study of penetration mechanism of labrasol on rabbit cornea by Ussing chamber, RT-PCR assay, Western blot and immunohistochemistry. Asian Journal of Pharmaceutical Sciences. 14, 329-339 (2019).
- Okabe, K., et al. Effect of Benzalkonium Chloride on transscleral drug delivery. Investigative Opthalmology & Visual Science. 46, 703 (2005).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
- Kozuka, K., et al. Development and characterization of a human and mouse intestinal epithelial cell monolayer platform. Stem Cell Reports. 9, 1976-1990 (2017).
- Tamura, A., et al. Megaintestine in claudin-15-deficient mice. Gastroenterology. 134, 523-534 (2008).
- Nakayama, M., Ishizuka, N., Hempstock, W., Ikari, A., Hayashi, H. Na+-coupled nutrient cotransport induced luminal negative potential and Claudin-15 play an important role in paracellular Na+ recycling in mouse small intestine. International Journal of Molecular Sciences. 21, 376 (2020).
- Tamura, A., et al. Loss of claudin-15, but not claudin-2, causes Na+ deficiency and glucose malabsorption in mouse small intestine. Gastroenterology. 140, 913-923 (2011).
- Clarke, L. L. A guide to Ussing chamber studies of mouse intestine. American Journal of Physiology – Gastrointestinal and Liver Physiology. 296, (2009).
- Dobson, J. G., Kidder, G. W. Edge damage effect in in vitro frog skin preparations. American Journal of Physiology. 214, 719-724 (1968).
- Corman, B. Streaming potentials and diffusion potentials across rabbit proximal convoluted tubule. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 403, 156-163 (1985).
- Shen, L., Weber, C. R., Raleigh, D. R., Yu, D., Turner, J. R. Tight junction pore and leak pathways: A dynamic duo. Annual Review of Physiology. 73, 283-309 (2011).
- Frizzell, R. A., Schultz, S. G. Ionic conductances of extracellular shunt pathway in rabbit ileum. Journal of General Physiology. 59, 318-346 (1972).
- Otani, T., et al. Claudins and JAM-A coordinately regulate tight junction formation and epithelial polarity. Journal of Cell Biology. 218, 3372-3396 (2019).
