Functionele beoordeling van intestinale tight junction barrier en ionendoorlaatbaarheid in inheems weefsel door Ussing Chamber Technique
Summary
Darmepitheel verleent niet alleen opname van voedingsstoffen, maar ook bescherming tegen schadelijke stoffen. De apicale meest epitheliale intercellulaire junctie, d.w.z. de tight junction, reguleert paracellulaire opgeloste stof en ionenpermeabiliteit. Hier wordt een protocol beschreven voor de bereiding van mucosale vellen en beoordeling van de ionenselectiviteit van tight junctions met behulp van Ussing-kamertechniek.
Abstract
De Ussing-kamertechniek werd voor het eerst uitgevonden door de Deense wetenschapper Hans Ussing in 1951 om het transcellulaire transport van natrium over kikkerhuid te bestuderen. Sindsdien is deze techniek op veel verschillende weefsels toegepast om de fysiologische parameters van transport over membranen te bestuderen. De Ussing-kamermethode heeft de voorkeur boven andere methoden omdat inheems weefsel kan worden gebruikt, waardoor het meer van toepassing is op wat er in vivo gebeurt. Omdat echter inheems weefsel wordt gebruikt, is de doorvoer laag, is de tijd beperkt en vereist weefselvoorbereiding vaardigheid en training. Deze kamers zijn gebruikt om specifieke transporteiwitten in verschillende weefsels te bestuderen, ziektepathofysiologie zoals bij Cystic Fibrosis te begrijpen, het transport en de opname van geneesmiddelen te bestuderen en vooral bij te dragen aan het begrip van het transport van voedingsstoffen in de darm. Gezien het hele epitheliale transportproces van een weefsel, zijn niet alleen transepitheliale paden, maar ook paracellulaire paden belangrijk. Tight junctions zijn een belangrijke determinant van weefselspecifieke paracellulaire permeabiliteit in de darm. In dit artikel zal de Ussing-kamertechniek worden gebruikt om de paracellulaire permselectiviteit van ionen te beoordelen door transepitheliale geleiding en verdunningspotentialen te meten.
Introduction
De Ussing-kamermethode werd voor het eerst ontwikkeld door de Deense wetenschapper Hans Ussing. Ussing gebruikte het voor het eerst om de kortsluitstroom van natriumtransport over de kikkerhuid te meten nadat was waargenomen dat NaCl over de huid kon worden getransporteerd tegen een steile concentratiegradiënt1. Zijn systeem bestond uit de kikkerhuid gemonteerd tussen twee kamers met toegang tot beide zijden van de huid. Elke kamer bevatte ringer’s oplossing die werd gecirculeerd en belucht. Twee smalle agar ringerbruggen in de buurt van de huid en verbonden met verzadigde KCl-calomel elektroden maten het potentiaalverschil zoals afgelezen door een potentiator. Een tweede paar agar ringerbruggen bevonden zich aan het andere uiteinde van elke kamer verbonden met bekers met verzadigde KCl verzadigd met AgCl om een elektromotorische kracht uit te oefenen die door een batterij wordt geleverd. Een potentiaalverdeler werd gebruikt om de spanning aan te passen, zodat het potentiaalverschil over de huid nul bleef, waardoor kortsluitingsomstandigheden ontstonden. Er werd ook een microampèremeter aangesloten om de stroom af te lezen die door de huid gaat (zie de figuur in ref.1 voor het oorspronkelijke kamerontwerp).
In de afgelopen 70 jaar is deze techniek toegepast op veel verschillende weefsels, met name darmweefsel, om het transport van voedingsstoffen en ionen te bestuderen. Het mechanisme van cholera-geïnduceerde diarree werd bijvoorbeeld bestudeerd door konijnenileum in deze kamers te monteren, en het bleek dat cholera toxine-geïnduceerde diarree wordt gemedieerd door cAMP2. Daarnaast werden deze kamers ook gebruikt om het mechanisme te bestuderen dat ten grondslag ligt aan glucosetransport via Na+-Glucose cotransporter 1 (SGLT1)3. Ons lab richt zich op transcellulair en paracellulair transport in darmepitheelcellen. Met behulp van de Ussing-kamermethode werd peptidetransport beoordeeld in Claudin 15 knock-out muizen, die een verminderd paracellulair natriumtransport hebben, met behulp van Ussing-kamers om de absorptie van het niet-hydrolyseerbare dipeptide glycylsarcosine te meten. Het bleek dat luminale Na + homeostase belangrijk is voor proton-gekoppeld peptidetransport4. Bovendien werden deze kamers ook gebruikt om anionsecretie in de muriene blindedarm te onderzoeken als reactie op submucosale activering van proteïnase-geactiveerde receptor 1 door het serineprotease trypsine5.
Ussingkamers zijn onlangs ook gebruikt om de paracellulaire routes in epitheelweefsel te beoordelen. Paracellulaire routes worden gereguleerd door tight junctions, dat zijn complexen van eiwitten die zich vormen op het punt waar twee of meer cellen elkaar ontmoeten6. De barrièrefunctie en ionenselectiviteit (of anionen of kationen selectief door de tight junction kunnen gaan) wordt bepaald door de aanwezigheid van claudin-familie-eiwitten; waarvan sommige fungeren als barrières (claudin 3 en 7), anionporiën (claudin 10a) of kationporiën (claudin 2, 10b en 15)7. Andere methoden zijn gebruikt om de paracellulaire route te beoordelen, zoals orale maagsonde van FITC vergezeld van bloedplasma FITC-concentratie8, of EDTA-Cr9; deze technieken hebben echter een lagere resolutie en kunnen de ionenselectiviteit of een specifiek deel van de delen van het darmkanaal niet beoordelen. Ussingkamers kunnen echter worden gebruikt om het verdunningspotentieel van doelionen te beoordelen en daarom de ionenselectiviteit van de tight junctions te bepalen. Met NaCl kan bijvoorbeeld de selectiviteit van de tight junctions voor Na+ en Cl– worden berekend door één kant van het membraan (meestal de mucosale kant) te verdunnen en de verandering in transepitheliaal potentiaalverschil te meten. De relatieve permeabiliteiten van Na+ en Cl– kunnen worden geschat met de Goldman-Hodgkin-Katz-vergelijking10 en de selectiviteit van de tight junction kan worden geschat met behulp van de Kimizuka-Koketsu-vergelijking11. Deze kamers hebben daarom het voordeel dat ze de elektrofysiologische parameters van weefsel meten en als gevolg daarvan meer informatie geven over de passage van ionen door de tight junctions dan andere methoden met een lagere resolutie.
De Ussing-kamermethode is niet alleen beperkt tot het darmkanaal, hoewel het veel wordt gebruikt in onderzoeken naar de darm, het heeft ook vele andere toepassingen. Deze kamers zijn bijvoorbeeld gebruikt om Cystic Fibrosis te bestuderen, en specifiek het chloridekanaal cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)12. Cystic Fibrosis wordt veroorzaakt door een mutatie in CFTR13, wat resulteert in verminderde chloridesecretie en vloeistoftransport door respiratoire epitheelcellen, en een resulterende dikkere, drogere slijmlaag14. Studie van luchtwegepitheel CFTR is uitgevoerd met deze kamers om niet alleen de ziekte te begrijpen, maar ook om manieren te ontdekken om de ziekte te behandelen. Bij patiënten met zeldzame mutaties die cystische fibrose veroorzaken, is bijvoorbeeld analyse van respiratoire epitheelcellen van de patiënt gebruikt om therapieën zoals Orkambi en een co-therapie met versterkers te testen15.
Ussing-kamers zijn ook gebruikt om routes van medicijnafgifte te bestuderen, zoals met menselijk biopsieweefsel om medicijnopname en farmacokinetiek te bestuderen16. Intestinale opname is niet de enige route van medicijnafgifte. Deze kamers zijn ook gebruikt om nasale medicijnafgiftesystemen te bestuderen17. Geneesmiddelenafgiftestudies met Ussing-kamers zijn ook uitgevoerd voor het oog. In het hoornvlies van konijnen werden permeabiliteits- en opnamestudies uitgevoerd met Labrasol, een medicijn dat is ontworpen om de absorptie van geneesmiddelen in weefsels te verhogen18. Een andere studie onderzocht het effect van benzylalkoniumchloride op transsclerale medicijnafgifte bij het konijn sclera19.
De Ussing-kamermethode is nuttig omdat inheems weefsel kan worden gebruikt. Als zodanig heeft het de voorkeur boven in vitro modellen zoals Caco-2 cellijnen. De techniek vereist echter vaardigheid en tijd om monsters voor te bereiden, dus het is niet geschikt voor toepassingen met een hoge doorvoer. De elektrofysiologische eigenschappen van celmonolagen kunnen worden bestudeerd met behulp van celkweekinzetstukken in deze kamers. Recente ontdekkingen hebben de kweek van organoïden mogelijk gemaakt, mini-organen die in cultuur worden gekweekt uit de oogst van epitheliale of endotheelstamcellen20. Organoïde cultuur kan worden gemanipuleerd om in een monolaag te worden gekweekt, waardoor het mogelijk wordt om organoïden in een Ussing-kamer te monteren21. Organoïden van verschillende epitheliale en endotheelweefsels kunnen worden bestudeerd, waardoor het aantal vereiste dieren wordt verlaagd, omdat organoïdecultuur op lange termijn kan worden gehandhaafd. Dit zal ook de doorvoer verhogen, omdat tijdrovende en moeizame weefseldissectie en voorbereidingsstappen niet nodig zijn. In de toekomst zullen Ussing kamerstudies zeer nuttig blijven voor het bestuderen van weefseltransport en ze zullen vooral belangrijk zijn op het gebied van gepersonaliseerde geneeskunde.
Het volgende protocol demonstreert de toepassing van de Ussing-kamermethode om de permselectiviteit en barrièrefunctie van de tight junctions in de dunne darm van Claudin 15 knockout (Cldn15-/-) muizen en wildtype (WT) controles te beoordelen door het verdunningspotentieel van NaCl te meten. Tight junctions (TJ) worden gevormd op het punt waar twee of meer cellen elkaar ontmoeten in epitheel- en endotheelweefsel. Bicellulaire tight junctions (bTJ), met name de claudin-familie-eiwitten die worden aangetroffen in de bTJ, worden verondersteld de barrièrefunctie en permselectiviteit van TJ7 te bepalen. Cldn15-/- muizen hebben een mega dunne darm22 en verminderde opnamecapaciteit van voedingsstoffen als gevolg van het verlies van intestinale Na + recycling dat optreedt via claudin 154,23,24. Cldn15-/- muizen hebben een verminderde Na+ homeostase, waardoor ze een interessant model zijn voor het bestuderen van de permselectiviteit van de TJ. Het volgende protocol beoordeelt de permeabiliteit van de TJ tot NaCl door het meten van het verdunningspotentieel van NaCl (PNa/PCl) in de middelste dunne darm. Kortom, de verandering in membraanpotentiaalverschil die optreedt door verdunning van één kant van het membraan (M-kant of S-kant, beide worden gemeten in het onderstaande protocol) kan worden gebruikt om de permeabiliteit van Na + (PNa) en Cl– (PCl) te berekenen, en de verdunningspotentiaal (PNa / PCl) zal aantonen of de tight junction een kationische of anionische selectiviteit heeft.
De experimenten in dit protocol werden uitgevoerd met behulp van een aangepaste Ussing-kamer (figuur 1A), die bestaat uit twee helften, waartussen het darmpreparaat verticaal is gemonteerd, spanningsklemversterker, elektrische recorder, elektroden, zoutbruggen, Ringer’s oplossing, HEPES-buffer (150 mM NaCl), verdunde HEPES-buffer (75 mM NaCl), darmvoorbereiding (voor details over apparatuur zie de tabel met materialen).
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit experiment werden Ussing-kamers gebruikt om de elementaire elektrische parameters en het verdunningspotentieel van NaCl in de dunne darm van Cldn15-/- en WT-muizen te meten. Het is erg belangrijk bij het uitvoeren van Ussing-kamerexperimenten om te verifiëren of het membraanpreparaat dat in de experimenten wordt gebruikt, levensvatbaar is. Dit wordt meestal gedaan door glucose of de adenylaatcyclase activator forskolin toe te voegen en te kijken of er een geschikte stijging is in Isc<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt ondersteund door 17K00860 (naar HH) en 19K20152 (naar NI). WH wil graag de Otsuka Toshimi Scholarship Foundation bedanken voor hun financiële steun van 2018-2021.
Materials
| #3 polyethyl tubing | Hibiki | outer diameter 1.0 mm; inner diameter 0.5 mm | |
| #7 polyethyl tubing | Hibiki | outer diameter 2.3 mm; inner diameter 1.3 mm | |
| 10 mL locking syringe | Terumo | SS-10LZ | Locking syringes are necessary to prevent the needle from dislodging during filling |
| 19 g needle | Terumo | NN-1938R | Please use caution when working with needles and dispose of in sharps container |
| 23 g needle | Terumo | NN-2332R | Please use caution when working with needles and dispose of in sharps container |
| 5 mm punch | NA | NA | Use to punch holes in filter paper and parafilm |
| acupuncture needles | Seirin | NS | Used as dissection pins to pin tissue to dissection plate |
| Agar | Fujifilm Wako | 010-15815 | |
| Alligator clips | NA | NA | Connects the electrode to the amplifier |
| CaCl2 | Fujifilm Wako | 038-00445 | |
| D(-)-Mannitol | Fujifilm Wako | 133-00845 | This is used to correct for the osmolality difference in dilution HEPES buffer |
| D(+)-Glucose | Fujifilm Wako | 049-31165 | |
| Dissection kit | You will need, scissors and curved forceps | ||
| Dissection plates | We used 10 cm cell culture plates and covered with silicon rubber | ||
| DMSO | Sigma | 472301-500ML | For making forskolin stock |
| Electrical recorder | TOA Electronics | PRR-5041 | Other equivalent electrical recorders are available commercially |
| Epithelial voltage clamp amplifier | Nihon Kohden | CEZ9100 | Other equivalent amplifiers are available commerically |
| filter paper, cut into squares | NA | NA | Punched with a 5 mm punch, used to hold intestinal preparation |
| fine forceps | Fast Gene | FG-B50476 | For blunt dissection of the muscle layer |
| Forskolin | Alomone Labs | F-500 | Make 10 mM stock in DMSO, final concentration will be 10 µM |
| HEPES | Sigma | H4034-1KG | |
| Indomethacin | Sigma | I7338-5G | Make a 1 mM stock in 21 mM NaHCO3, final concentration is 10 µM |
| K2HPO4 | Fujifilm Wako | 164-04295 | |
| KCl | Fujifilm Wako | 163-03545 | |
| KCl/calomel electrode | Asch Japan Co. | SCE-100 | |
| KH2PO4 | Kanto chemical | 32379-00 | |
| L(+)-Glutamine | Fujifilm Wako | 074-00522 | |
| MgCl2 | Fujifilm Wako | 135-00165 | |
| Mixed Gas (95% O2/5% CO2) | Shizuoka Oxygen Company | Used for bubbling Ringer solution and chambers when using Ringer solution | |
| NaCl | Fujifilm Wako | 191-01665 | |
| NaCl electrode | NA | NA | Handmade electrodes which require concentrated NaCl and Silver wire |
| NaHCO3 | Fujifilm Wako | 191-01305 | |
| O2 Gas | Shizuoka Oxygen Company | Used for bubbling chambers when using HEPES buffer | |
| parafilm | Bemis | PM-996 | Used to help seal Ussing chambers |
| pH meter | DKK-TOA Corp | HM-305 | HEPES buffer needs to be adjusted to pH 7.4 at 37 °C |
| pH meter electrode | DKK-TOA Corp | GST-5311C | |
| silicone rubber | Shinetsu Chemical | KE-12 | Used to fill dissection plates |
| silver wire | Used for making NaCl electrodes | ||
| Small jars w/ plastic lids | NA | NA | Use for NaCl electrodes |
| stereomicroscope | Zeiss | Stemi 305 | A stereomicroscope allows you to see depth, so you can dissect the tissue more easily |
| Tris (Trizma base) | Sigma | T1503-1KG | Make a 1M solution to adjust pH of HEPES buffers |
| Ussing chambers | Sanki Kagaku Kougei | These chambers are custom made continuous perfusion Ussing chambers with a window diameter of 5 mm | |
| Water pump and heating system | Tokyo Rikakikai Co. Ltd. | NTT-110 |
References
- Ussing, H. H., Zerahn, K. Active transport of sodium as the source of electric current in the short-circuited isolated frog skin. Acta Physiologica Scandinavica. 23, 110-127 (1951).
- Field, M. Ion transport in rabbit ileal mucosa. II. Effects of cyclic 3′, 5′-AMP. American Journal of Physiology – Legacy Content. 221, 992-997 (1971).
- Herrmann, J. R., Turner, J. R. Beyond Ussing’s chambers: contemporary thoughts on integration of transepithelial transport. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 310, 423-431 (2015).
- Ishizuka, N., et al. Luminal Na + homeostasis has an important role in intestinal peptide absorption in vivo. American Journal of Physiology – Gastorintestinal and Liver Physiology. 315, 799-809 (2018).
- Ikehara, O., et al. Subepithelial trypsin induces enteric nerve-mediated anion secretion by activating proteinase-activated receptor 1 in the mouse cecum. Journal of Physiological Sciences. 62, 211-219 (2012).
- Furuse, M. Molecular basis of the core structure of tight junctions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 002907 (2010).
- Tsukita, S., Tanaka, H., Tamura, A. The claudins: From tight junctions to biological systems. Trends in Biochemical Sciences. 44, 141-152 (2019).
- Li, B. R., et al. In vitro and in vivo approaches to determine intestinal epithelial cell permeability. Journal of Visual Experiments: JoVE. , e57032 (2018).
- Schoultz, I., Keita, &. #. 1. 9. 7. ;. V. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9, (2020).
- Yu, A. S. L., et al. Molecular basis for cation selectivity in claudin-2-based paracellular pores: Identifi cation of an electrostatic interaction site. Journal of General Physiology. 133, 111-127 (2009).
- Kimizuka, H., Koketsu, K. Ion transport through cell membrane. Journal of Theoretical Biology. 6, 290-305 (1964).
- Li, H., Sheppard, D. N., Hug, M. J. Transepithelial electrical measurements with the Ussing chamber. Journal of Cystic Fibrosis. 3, 123-126 (2004).
- Riordan, J. R., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: Cloning and characterization of complementary DNA. Science. 245, 1066-1073 (1989).
- Smith, J. J., Karp, P. H., Welsh, M. J. Defective fluid transport by cystic fibrosis airway epithelia. Journal of Clinical Investigation. 93, 1307-1311 (1994).
- Molinski, S. V., et al. Orkambi and amplifier co-therapy improves function from a rare CFTR mutation in gene-edited cells and patient tissue. EMBO Molecular Medicine. 9, 1224-1243 (2017).
- Kisser, B., et al. The Ussing chamber assay to study drug metabolism and transport in the human intestine. Current Protocols in Pharmacology. 77, 1-19 (2017).
- Östh, K. . The horizontal Ussing chamber method in studies of nasal drug delivery – Method Delopment and Applications Using Different Formulations. , (2002).
- Guo, P., et al. Study of penetration mechanism of labrasol on rabbit cornea by Ussing chamber, RT-PCR assay, Western blot and immunohistochemistry. Asian Journal of Pharmaceutical Sciences. 14, 329-339 (2019).
- Okabe, K., et al. Effect of Benzalkonium Chloride on transscleral drug delivery. Investigative Opthalmology & Visual Science. 46, 703 (2005).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
- Kozuka, K., et al. Development and characterization of a human and mouse intestinal epithelial cell monolayer platform. Stem Cell Reports. 9, 1976-1990 (2017).
- Tamura, A., et al. Megaintestine in claudin-15-deficient mice. Gastroenterology. 134, 523-534 (2008).
- Nakayama, M., Ishizuka, N., Hempstock, W., Ikari, A., Hayashi, H. Na+-coupled nutrient cotransport induced luminal negative potential and Claudin-15 play an important role in paracellular Na+ recycling in mouse small intestine. International Journal of Molecular Sciences. 21, 376 (2020).
- Tamura, A., et al. Loss of claudin-15, but not claudin-2, causes Na+ deficiency and glucose malabsorption in mouse small intestine. Gastroenterology. 140, 913-923 (2011).
- Clarke, L. L. A guide to Ussing chamber studies of mouse intestine. American Journal of Physiology – Gastrointestinal and Liver Physiology. 296, (2009).
- Dobson, J. G., Kidder, G. W. Edge damage effect in in vitro frog skin preparations. American Journal of Physiology. 214, 719-724 (1968).
- Corman, B. Streaming potentials and diffusion potentials across rabbit proximal convoluted tubule. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 403, 156-163 (1985).
- Shen, L., Weber, C. R., Raleigh, D. R., Yu, D., Turner, J. R. Tight junction pore and leak pathways: A dynamic duo. Annual Review of Physiology. 73, 283-309 (2011).
- Frizzell, R. A., Schultz, S. G. Ionic conductances of extracellular shunt pathway in rabbit ileum. Journal of General Physiology. 59, 318-346 (1972).
- Otani, T., et al. Claudins and JAM-A coordinately regulate tight junction formation and epithelial polarity. Journal of Cell Biology. 218, 3372-3396 (2019).
