ウッシングチャンバー技術による在来組織における腸タイトジャンクションバリアとイオン透過性の機能評価
Summary
腸上皮は、栄養素の吸収だけでなく、有害物質に対する保護も与えます。頂端 – 最上皮細胞間接合部、すなわちタイトジャンクションは、傍細胞溶質およびイオン透過性を調節する。ここでは、粘膜シートの調製およびUssingチャンバー技術を用いたタイトジャンクションのイオン選択性の評価のためのプロトコルが記載されている。
Abstract
ウッシングチャンバー技術は、カエルの皮膚を横切るナトリウムの細胞間輸送を研究するために、1951年にデンマークの科学者Hans Ussingによって最初に発明されました。それ以来、この技術は、膜を横切る輸送の生理学的パラメータを研究するために、多くの異なる組織に適用されてきた。Ussingチャンバー法は、天然組織を使用できるため、他の方法よりも好ましく、 生体内で起こっていることにより適用可能である。しかし、天然組織が使用されるため、スループットが低く、時間が限られ、組織調製にはスキルとトレーニングが必要です。これらのチャンバーは、様々な組織における特定のトランスポータータンパク質の研究、嚢胞性線維症などの疾患病態生理学の理解、薬物輸送および取り込みの研究、および腸内の栄養輸送の理解に特に貢献するために使用されてきた。組織の上皮輸送プロセス全体を考えると、経上皮経路だけでなく、傍細胞経路も重要である。タイトジャンクションは、腸を横切る組織特異的な傍細胞透過性の重要な決定因子である。この記事では、Ussingチャンバー技術を使用して、経上皮コンダクタンスと希釈電位を測定することによってイオンの傍細胞透過性を評価します。
Introduction
ウッシングチャンバー法は、デンマークの科学者ハンス・ウッシングによって最初に開発されました。Ussingは、NaClが急峻な濃度勾配に対して皮膚を横切って輸送できることが観察された後、カエルの皮膚を横切るナトリウム輸送の短絡電流を測定するために最初にそれを使用した1。彼のシステムは、皮膚の両側にアクセスできる2つの部屋の間に取り付けられたカエルの皮膚で構成されていました。各チャンバーにはリンゲルの溶液が含まれており、それらは循環され、曝気された。皮膚の近くに位置し、飽和KCl-カロメル電極に接続された2つの狭い寒天リンガーブリッジは、ポテンショネータによって読み取られた電位差を測定した。第2の対の寒天リンガーブリッジは、AgClで飽和した飽和KClを有するビーカーに接続された各チャンバの反対側の端に位置し、電池によって提供される起電力を印加した。電位分配器を使用して電圧を調整し、皮膚両端の電位差がゼロのままになるようにし、短絡状態を作り出しました。マイクロアンペアメーターも接続され、皮膚を通過する電流を読み取ることができました(元のチャンバー設計については、参考文献1 の図を参照)。
過去70年以上にわたり、この技術は、栄養素およびイオン輸送を研究するために、多くの異なる組織、特に腸組織に適用されてきた。例えば、これらのチャンバーにウサギ回腸を装着することにより、コレラ誘発性下痢のメカニズムを調べたところ、コレラ毒素誘発性下痢がcAMP2によって媒介されることが分かりました。さらに、これらのチャンバーは、Na+グルコース共輸送体1(SGLT1)3を介したグルコース輸送の根底にあるメカニズムを研究するためにも使用された。私たちの研究室では、腸上皮細胞における細胞間および傍細胞輸送に焦点を当てています。Ussingチャンバー法を用いて、ペプチド輸送を、傍細胞ナトリウム輸送を障害したクローディン15ノックアウトマウスにおいて評価し、ウッシングチャンバーを用いて、非加水分解性ジペプチドグリシルサルコシンの吸収を測定した。管腔内Na+ 恒常性がプロトン結合ペプチド輸送に重要であることが判明した4。加えて、これらのチャンバーは、セリンプロテアーゼトリプシン5によるプロテイナーゼ活性化受容体1の粘膜下活性化に応答したマウス盲腸における陰イオン分泌を調べるためにも使用された。
ウッシングチャンバーは、最近、上皮組織における傍細胞経路を評価するためにも使用されている。傍細胞経路は、2つ以上の細胞が出会う時点で形成されるタンパク質の複合体であるタイトジャンクションによって調節される6。バリア機能およびイオン選択性(アニオンまたはカチオンがタイトジャンクションを選択的に通過できるかどうか)は、クローディンファミリータンパク質の存在によって決定される。そのうちのいくつかは、障壁(クローディン3および7)、アニオン細孔(クローディン10a)、またはカチオン細孔(クローディン2、10b、および15)7として作用する。血漿FITC濃度8、またはEDTA-Cr9を伴うFITCの経口経管栄養などの他の方法が、傍細胞経路を評価するために使用されている。しかしながら、これらの技術は分解能が低く、イオン選択性または腸管のセクションの特定のセクションを評価することができない。しかし、ウッシングチャンバーは、標的イオンの希釈電位を評価するために使用でき、したがって、タイトジャンクションのイオン選択性を決定することができる。例えば、NaClでは、Na+およびCl–に対するタイトジャンクションの選択性は、膜の片側(通常は粘膜側)を希釈し、経上皮電位差の変化を測定することによって計算することができる。Na+とCl–の相対透過性はゴールドマン・ホジキン・カッツの式10で推定でき、タイトジャンクションの選択性は君塚・コケツの式11で推定できます。したがって、これらのチャンバは、組織の電気生理学的パラメータを測定するという利点を有し、その結果、他の低分解能方法よりもタイトジャンクションを通るイオンの通過に関するより多くの情報を提供する。
ウッシングチャンバー法は腸管に限定されず、腸に関する研究で広く使用されていますが、他にも多くの用途があります。例えば、これらのチャンバーは、嚢胞性線維症、特に塩化チャネル嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンスレギュレーター(CFTR)12を研究するために使用されている。嚢胞性線維症は、CFTR13の変異によって引き起こされ、呼吸器上皮細胞による塩化物分泌および流体輸送の障害をもたらし、その結果、より厚く乾燥した粘液層14が生じる。気道上皮CFTRの研究は、疾患を理解するだけでなく、疾患を治療する方法を発見するために、これらのチャンバーで行われてきた。例えば、嚢胞性線維症を引き起こす稀な変異を有する患者では、患者の呼吸器上皮細胞の分析が、Orkambiやアンプ共療法などの治療法をテストするために使用されてきた15。
ussingチャンバーは、薬物の取り込みや薬物動態を研究するためのヒト生検組織など、薬物送達経路の研究にも使用されています16。腸の取り込みは、薬物送達の唯一の経路ではない。これらのチャンバーは、鼻の薬物送達システムの研究にも使用されています17。Ussingチャンバーを用いた薬物送達研究も眼のために行われている。ウサギの角膜では、組織全体で薬物の吸収を増加させるように設計された薬物であるラブラゾールを用いて、透過性および取り込み試験が実施された18。別の研究では、ウサギ強膜における経強膜薬物送達に対する塩化ベンジルアルコニウムの効果を調べた19。
Ussingチャンバー法は、天然組織を使用できるため有用である。そのため、Caco-2細胞株などの インビトロ モデルに亘ることが好ましい。しかし、試料作製には熟練と時間が必要で、ハイスループットな用途には適していません。細胞単層の電気生理学的特性は、これらのチャンバー内の細胞培養インサートを用いて研究することができる。最近の発見により、上皮幹細胞または内皮幹細胞の採取から培養中に増殖したミニ臓器であるオルガノイドの培養が可能になりました20。オルガノイド培養物は、単層で増殖するように操作することができ、それによって、オルガノイドをUssingチャンバー21にマウントすることを可能にする。様々な上皮および内皮組織のオルガノイドを研究することができ、オルガノイド培養を長期間維持することができるので、必要な動物の数を減らすことができる。これはまた、時間がかかり、面倒な組織解剖および調製ステップが不要になるため、スループットを向上させます。将来的には、Ussingチャンバー研究は組織輸送の研究に非常に有用であり続け、個別化医療の分野で特に重要になるでしょう。
以下のプロトコルは、NaClの希釈電位を測定することによって、クローディン15ノックアウト(Cldn15-/-)マウスおよび野生型(WT)コントロールの小腸におけるタイトジャンクションの透過選択性およびバリア機能を評価するためのUssingチャンバー法の適用を実証する。タイトジャンクション(TJ)は、上皮および内皮組織において2つ以上の細胞が出会う点で形成される。二細胞タイトジャンクション(bTJ)、特にbTJ内に見られるクローディンファミリータンパク質は、TJ7のバリア機能および透過選択性を決定すると考えられている。Cldn15-/-マウスは、巨大小腸22を有し、クローディン154、23、24を介して起こる腸内Na+リサイクルの喪失による栄養素取り込み能力の低下を有する。Cldn15-/- マウスはNa+恒常性を損ねており、TJのパーマセレクティビティを研究するための興味深いモデルとなっています。以下のプロトコルは、中小腸におけるNaCl(PNa/PCl)の希釈電位を測定することにより、TJからNaClへの透過性を評価する。簡単に言えば、膜の片側(M側またはS側、どちらも以下のプロトコルで測定される)を希釈することによって生じる膜電位差の変化は、Na+(PNa)およびCl–(PCl)の透過性を計算するために使用することができ、希釈電位(PNa/PCl)は、タイトジャンクションがカチオン性またはアニオン性の選択性を有するかどうかを示す。
このプロトコールの実験は、腸管製剤が垂直に取り付けられた2つの半分からなるカスタマイズされたUssingチャンバ(図1A)、電圧クランプアンプ、電気レコーダー、電極、塩橋、リンゲル溶液、HEPES緩衝液(150mM NaCl)、希釈HEPES緩衝液(75mM NaCl)、腸製剤(機器の詳細については 材料表を参照)。
Protocol
Representative Results
Discussion
この実験では、Ussingチャンバーを使用して、Cldn15−/−およびWTマウスの小腸におけるNaClのベースライン電気パラメータおよび希釈電位を測定した。Ussingチャンバー実験を行う際には、実験で使用した膜調製物が実行可能であることを確認することが非常に重要です。これは通常、グルコースまたはアデニル酸シクラーゼ活性化剤フォルスコリンを添加し、Isc(マ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、17K00860 (HH 宛) および 19K20152 (NI 宛) でサポートされています。WHは、2018年から2021年までの大塚俊美奨学財団の財政的支援に感謝します。
Materials
| #3 polyethyl tubing | Hibiki | outer diameter 1.0 mm; inner diameter 0.5 mm | |
| #7 polyethyl tubing | Hibiki | outer diameter 2.3 mm; inner diameter 1.3 mm | |
| 10 mL locking syringe | Terumo | SS-10LZ | Locking syringes are necessary to prevent the needle from dislodging during filling |
| 19 g needle | Terumo | NN-1938R | Please use caution when working with needles and dispose of in sharps container |
| 23 g needle | Terumo | NN-2332R | Please use caution when working with needles and dispose of in sharps container |
| 5 mm punch | NA | NA | Use to punch holes in filter paper and parafilm |
| acupuncture needles | Seirin | NS | Used as dissection pins to pin tissue to dissection plate |
| Agar | Fujifilm Wako | 010-15815 | |
| Alligator clips | NA | NA | Connects the electrode to the amplifier |
| CaCl2 | Fujifilm Wako | 038-00445 | |
| D(-)-Mannitol | Fujifilm Wako | 133-00845 | This is used to correct for the osmolality difference in dilution HEPES buffer |
| D(+)-Glucose | Fujifilm Wako | 049-31165 | |
| Dissection kit | You will need, scissors and curved forceps | ||
| Dissection plates | We used 10 cm cell culture plates and covered with silicon rubber | ||
| DMSO | Sigma | 472301-500ML | For making forskolin stock |
| Electrical recorder | TOA Electronics | PRR-5041 | Other equivalent electrical recorders are available commercially |
| Epithelial voltage clamp amplifier | Nihon Kohden | CEZ9100 | Other equivalent amplifiers are available commerically |
| filter paper, cut into squares | NA | NA | Punched with a 5 mm punch, used to hold intestinal preparation |
| fine forceps | Fast Gene | FG-B50476 | For blunt dissection of the muscle layer |
| Forskolin | Alomone Labs | F-500 | Make 10 mM stock in DMSO, final concentration will be 10 µM |
| HEPES | Sigma | H4034-1KG | |
| Indomethacin | Sigma | I7338-5G | Make a 1 mM stock in 21 mM NaHCO3, final concentration is 10 µM |
| K2HPO4 | Fujifilm Wako | 164-04295 | |
| KCl | Fujifilm Wako | 163-03545 | |
| KCl/calomel electrode | Asch Japan Co. | SCE-100 | |
| KH2PO4 | Kanto chemical | 32379-00 | |
| L(+)-Glutamine | Fujifilm Wako | 074-00522 | |
| MgCl2 | Fujifilm Wako | 135-00165 | |
| Mixed Gas (95% O2/5% CO2) | Shizuoka Oxygen Company | Used for bubbling Ringer solution and chambers when using Ringer solution | |
| NaCl | Fujifilm Wako | 191-01665 | |
| NaCl electrode | NA | NA | Handmade electrodes which require concentrated NaCl and Silver wire |
| NaHCO3 | Fujifilm Wako | 191-01305 | |
| O2 Gas | Shizuoka Oxygen Company | Used for bubbling chambers when using HEPES buffer | |
| parafilm | Bemis | PM-996 | Used to help seal Ussing chambers |
| pH meter | DKK-TOA Corp | HM-305 | HEPES buffer needs to be adjusted to pH 7.4 at 37 °C |
| pH meter electrode | DKK-TOA Corp | GST-5311C | |
| silicone rubber | Shinetsu Chemical | KE-12 | Used to fill dissection plates |
| silver wire | Used for making NaCl electrodes | ||
| Small jars w/ plastic lids | NA | NA | Use for NaCl electrodes |
| stereomicroscope | Zeiss | Stemi 305 | A stereomicroscope allows you to see depth, so you can dissect the tissue more easily |
| Tris (Trizma base) | Sigma | T1503-1KG | Make a 1M solution to adjust pH of HEPES buffers |
| Ussing chambers | Sanki Kagaku Kougei | These chambers are custom made continuous perfusion Ussing chambers with a window diameter of 5 mm | |
| Water pump and heating system | Tokyo Rikakikai Co. Ltd. | NTT-110 |
References
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