הערכה פונקציונלית של מחסום צומת הדוק מעיים וחדירות יון ברקמה המקומית על ידי טכניקת הקאמרית של ברית המועצות
Summary
אפיתל מעיים מעניק לא רק ספיגה תזונתיים אלא הגנה מפני חומרים מזיקים. הצומת הבין-תאי האפיתל ביותר אפיתל, כלומר, הצומת ההדוק, מווסת חדירה פרה-תאית וחדירות יונים. כאן מתואר פרוטוקול להכנת יריעות הרירית והערכה של הסלקטיביות היונית של צמתים הדוקים באמצעות טכניקת תא ברית המועצות.
Abstract
טכניקת הקאמרית של ברית המועצות הומצאה לראשונה על ידי המדען הדני הנס אוסינג בשנת 1951 כדי לחקור את ההובלה הטרנס-תאית של נתרן על פני עור צפרדע. מאז, טכניקה זו הוחלה על רקמות רבות ושונות כדי ללמוד את הפרמטרים הפיזיולוגיים של תחבורה על פני ממברנות. שיטת תא ברית המועצות עדיפה על שיטות אחרות מכיוון שניתן להשתמש ברקמה מקומית, מה שהופך אותה ליישום יותר למה שקורה ב- vivo. עם זאת, מכיוון שנעשה שימוש ברקמה מקומית, התפוקה נמוכה, הזמן מוגבל, והכנת רקמות דורשת מיומנות והכשרה. תאים אלה שימשו לחקר חלבוני טרנספורטר ספציפיים ברקמות שונות, להבין פתופיזיולוגיה של מחלות כגון סיסטיק פיברוזיס, ללמוד הובלת תרופות וספיגה, ובעיקר תרמו להבנת התחבורה התזונתית במעי. בהתחשב בכל תהליך ההובלה האפיתל של רקמה, לא רק מסלולים transepithelial, אלא גם מסלולים paracellular חשובים. צמתים הדוקים הם דטרמיננט מרכזי של חדירות פרה-תאית ספציפית לרקמה על פני המעי. במאמר זה, טכניקת תא ברית המועצות תשמש להערכת permselectivity paracellular של יונים על ידי מדידת מוליכות transepithelial ופוטנציאל דילול.
Introduction
שיטת ברית המועצות פותחה לראשונה על ידי המדען הדני הנס Ussing. ברית המועצות השתמשה בו לראשונה כדי למדוד את זרם המעגל הקצר של הובלת נתרן על פני עור צפרדע לאחר שנצפה כי NaCl יכול להיות מועבר על פני העור נגד שיפוע ריכוז תלול1. המערכת שלו כללה את עור הצפרדע שהורכב בין שני תאים עם גישה לשני צדי העור. כל תא הכיל את הפתרון של רינגר שהופץ ואוורר. שני גשרי אגר צלצול צרים הממוקמים ליד העור ומחוברים לאלקטרודות KCl-calomel רוויות מדדו את ההבדל הפוטנציאלי כפי שנקרא על ידי potentiator. זוג שני של גשרי אגר צלצול היו ממוקמים בקצה הנגדי של כל תא מחובר כוסות עם KCl רווי עם AgCl רווי עם AgCl ליישם כוח אלקטרומוטיב המסופק על ידי סוללה. חוצץ פוטנציאלי שימש כדי להתאים את המתח כך ההבדל הפוטנציאלי על פני העור נשאר אפס, ובכך ליצור תנאי קצר. מד מיקרואמפר חובר גם כדי לקרוא את הזרם העובר דרך העור (ראה את הדמות ב ref.1 לעיצוב החדר המקורי).
במהלך 70 השנים האחרונות, טכניקה זו הוחלה על רקמות רבות ושונות, במיוחד רקמת מעיים, כדי ללמוד תחבורה תזונתית ויונים. לדוגמה, המנגנון של שלשולים הנגרמים כולרה נחקר על ידי הרכבה איילום ארנב בתאים אלה, ונמצא כי שלשולים הנגרמים על ידי כולרה רעלן מתווך על ידי cAMP2. בנוסף, תאים אלה שימשו גם כדי ללמוד את המנגנון שבבסיס הובלת גלוקוז באמצעות Na +-גלוקוז cotransporter 1 (SGLT1)3. המעבדה שלנו מתמקדת בהובלה תאית ופראלילית בתאי אפיתל מעיים. באמצעות שיטת תא ברית המועצות, הובלת פפטיד הוערך בעכברים נוקאאוט קלודין 15, אשר פגעו בהובלת נתרן paracellular, באמצעות תאי ברית המועצות כדי למדוד את ספיגת דיפסטיד גליצילסרקוסין שאינו הידרוליזה. נמצא כי הומאוסטזיס Luminal Na+ חשוב להובלת פפטידים בזוג פרוטונים4. בנוסף, תאים אלה שימשו גם כדי לחקור הפרשת אניון ב cecum מורין בתגובה להפעלה תתmucosal של קולטן פעיל proteinase 1 על ידי סרין פרוטאז טריפסין5.
תאי ברית המועצות שימשו גם לאחרונה להערכת המסלולים הפארא-תאיים ברקמת האפיתל. מסלולים Paracellular מוסדר על ידי צמתים הדוקים, שהם קומפלקסים של חלבונים הנוצרים בנקודה שבה שני תאים או יותר נפגשים6. פונקציית המחסום וסלקטיביות היונים (בין אם אניונים או ציטוטים מסוגלים באופן סלקטיבי לעבור דרך הצומת ההדוק) נקבעת על ידי נוכחות של חלבונים ממשפחת קלודין; חלקם משמשים מחסומים (קלודין 3 ו -7), נקבוביות אניון (קלודין 10a), או נקבוביות קטיון (קלודין 2, 10b, ו 15)7. שיטות אחרות שימשו כדי להעריך את המסלול paracellular, כגון gavage אוראלי של FITC מלווה ריכוז FITC פלזמת דם8, או EDTA-Cr9; עם זאת, טכניקות אלה הן ברזולוציה נמוכה יותר ואינן יכולות להעריך סלקטיביות יונים או קטע מסוים של החלקים של מערכת העיכול. עם זאת, ניתן להשתמש בתאי ברית המועצות כדי להעריך את פוטנציאל הדילול של יוני המטרה, ולכן לקבוע את הסלקטיביות היונית של הצמתים ההדוקים. לדוגמה, עם NaCl, הסלקטיביות של הצמתים ההדוקים עבור Na + ו– Cl – ניתן לחשב על ידי דילול צד אחד של הממברנה (בדרך כלל הצד הרירי) ומדידת השינוי בהבדל הפוטנציאלי הטרנס-אפיטלי. ניתן להעריך את החדירות היחסית של Na+ ו– Cl- על ידי משוואת גולדמן-הודג’קין-כץ10 ואת הסלקטיביות של הצומת ההדוקה ניתן להעריך באמצעות משוואת קימישוקה-קוקטסו11. תאים אלה, אם כן, יש את היתרון של מדידת הפרמטרים האלקטרופיזיולוגיים של הרקמה וכתוצאה מכך לספק מידע רב יותר על המעבר של יונים דרך צמתים הדוקים מאשר שיטות ברזולוציה נמוכה יותר אחרות.
שיטת תא ברית המועצות אינה מוגבלת רק למערכת העיכול, אם כי היא נמצאת בשימוש נרחב במחקרים הנוגעים למעי, יש לה גם יישומים רבים אחרים. לדוגמה, תאים אלה שימשו כדי ללמוד סיסטיק פיברוזיס, ובמיוחד את ערוץ כלוריד סיסטיק פיברוזיס טרנסממברן רגולטור מוליכות (CFTR)12. סיסטיק פיברוזיס נגרמת על ידי מוטציה ב- CFTR13, אשר גורמת הפרשת כלוריד לקויה והובלת נוזלים על ידי תאי אפיתל נשימתיים, וכתוצאה מכך עבה יותר, ריריות יבשות יותר 14. מחקר של CFTR אפיתל דרכי הנשימה בוצע עם תאים אלה לא רק כדי להבין את המחלה, אבל כדי לגלות דרכים לטפל במחלה. לדוגמה, בחולים עם מוטציות נדירות הגורמות לסיסטיק פיברוזיס, ניתוח של תאי אפיתל נשימתיים של המטופל שימש לבדיקת טיפולים כגון Orkambi וטיפול משותף מגבר15.
חדרי ברית המועצות שימשו גם לחקר מסלולים של אספקת תרופות, כגון עם רקמת ביופסיה אנושית לחקר ספיגת תרופות ופרמקוקינטיקה16. ספיגת מעיים היא לא המסלול היחיד של אספקת סמים. תאים אלה שימשו גם לחקר מערכות אספקת תרופות לאף17. מחקרי משלוחי סמים עם חדרי ברית המועצות בוצעו גם עבור העין. בקרנית הארנב, חדירות ומחקרי ספיגה נערכו עם Labrasol, תרופה שנועדה להגביר את ספיגת התרופות על פני רקמות18. מחקר אחר בחן את ההשפעה של בנזילקוניום כלוריד על משלוח סמים טרנסקלרליים בסקלרה ארנבת19.
שיטת תא ברית המועצות שימושית מכיוון שניתן להשתמש ברקמה מקומית. ככזה, הוא עדיף על מודלים במבחנה כגון קווי תא Caco-2. עם זאת, הטכניקה דורשת מיומנות וזמן להכין דגימות, ולכן זה לא מתאים ליישומי תפוקה גבוהה. התכונות האלקטרופיזיולוגיות של monolayers התא ניתן ללמוד באמצעות תוספות תרבית התא בתאים אלה. תגליות אחרונות אפשרו את התרבות של organoids שהם מיני איברים הגדלים בתרבות מקציר של תאי גזע אפיתל או אנדותל20. תרבות האורגנויד ניתן לתמרן כדי לגדול ב monolayer, ובכך לאפשר להרכיב organoids בתא ברית המועצות21. אורגנוידים של רקמות אפיתל ואנדותל שונים ניתן לחקור, הפחתת מספר בעלי החיים הנדרשים, כמו תרבות organoid ניתן לשמור לטווח ארוך. זה גם יגדיל את התפוקה מאז זמן רב וחיתוך רקמות מייגע וצעדי הכנה לא יהיה צורך. בעתיד, לימודי חדר ברית המועצות ימשיכו להיות שימושיים מאוד לחקר הובלת רקמות והם יהיו חשובים במיוחד בתחום הרפואה המותאמת אישית.
הפרוטוקול הבא מדגים את היישום של שיטת תא ברית המועצות כדי להעריך את הסלקטיביות ואת תפקוד המחסום של הצמתים ההדוקים במעי הדק של קלודין 15 נוקאאוט (Cldn15-/-) עכברים וסוג פראי (WT) פקדים על ידי מדידת פוטנציאל הדילול של NaCl. צמתים הדוקים (TJ) נוצרים בנקודה שבה שני תאים או יותר נפגשים באפיתל ורקמת אנדותל. צמתים הדוקים Bicellular (bTJ), במיוחד חלבוני משפחת קלודין שנמצאו בתוך bTJ, נחשבים כדי לקבוע את תפקוד המחסום ואת הסלקטיביות של TJ7. Cldn15-/- עכברים יש מגה מעי דק22 ויכולת ספיגת חומרים מזינים מופחתת עקב אובדן מיחזור Na + מעיים המתרחשת באמצעות קלודין 154,23,24. Cldn15-/- עכברים יש לקוי Na + הומאוסטזיס, מה שהופך אותם מודל מעניין לחקר הסלקטיביות של TJ. הפרוטוקול הבא מעריך את החדירות של TJ ל- NaCl על ידי מדידת פוטנציאל הדילול של NaCl (PNa / PCl) במעי הדק האמצעי. בקצרה, השינוי בהבדל הפוטנציאלי של הממברנה המתרחש על ידי דילול צד אחד של הממברנה (צד M או צד S, שניהם נמדדים בפרוטוקול שלהלן) ניתן להשתמש כדי לחשב את החדירות של Na + (PNa) ו- Cl– (PCl), ואת פוטנציאל הדילול (PNa / PCl) יראה אם הצומת הדוק יש סלקטיביות קטנונית או אניונית.
הניסויים בפרוטוקול זה נערכו באמצעות תא ברית המועצות מותאם אישית (איור 1A), המורכב משני חצאים, ביניהם ההכנה במעיים מותקנת אנכית, מגבר מהדק מתח, מקליט חשמלי, אלקטרודות, גשרי מלח, הפתרון של רינגר, חיץ HEPES (150 מ”מ NaCl), חיץ HEPES מדולל (75 מ”מ NaCl), הכנה מעיים (לפרטים על ציוד ראו טבלת החומרים).
Protocol
Representative Results
Discussion
בניסוי זה, חדרי ברית המועצות שימשו למדידת הפרמטרים החשמליים הבסיסיים ואת פוטנציאל הדילול של NaCl במעי הדק של עכברי Cldn15-/- ו- WT. חשוב מאוד בעת ביצוע ניסויים בתא ברית המועצות כדי לוודא כי הכנת הממברנה המשמשת בניסויים היא בת קיימא. זה נעשה בדרך כלל על ידי הוספת גלוקוז או אדנילט ציקלאז ac…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי 17K00860 (ל- HH) ו- 19K20152 (ל- NI). WH רוצה להודות לקרן המלגות Otsuka Toshimi על תמיכתם הכספית בין השנים 2018-2021.
Materials
| #3 polyethyl tubing | Hibiki | outer diameter 1.0 mm; inner diameter 0.5 mm | |
| #7 polyethyl tubing | Hibiki | outer diameter 2.3 mm; inner diameter 1.3 mm | |
| 10 mL locking syringe | Terumo | SS-10LZ | Locking syringes are necessary to prevent the needle from dislodging during filling |
| 19 g needle | Terumo | NN-1938R | Please use caution when working with needles and dispose of in sharps container |
| 23 g needle | Terumo | NN-2332R | Please use caution when working with needles and dispose of in sharps container |
| 5 mm punch | NA | NA | Use to punch holes in filter paper and parafilm |
| acupuncture needles | Seirin | NS | Used as dissection pins to pin tissue to dissection plate |
| Agar | Fujifilm Wako | 010-15815 | |
| Alligator clips | NA | NA | Connects the electrode to the amplifier |
| CaCl2 | Fujifilm Wako | 038-00445 | |
| D(-)-Mannitol | Fujifilm Wako | 133-00845 | This is used to correct for the osmolality difference in dilution HEPES buffer |
| D(+)-Glucose | Fujifilm Wako | 049-31165 | |
| Dissection kit | You will need, scissors and curved forceps | ||
| Dissection plates | We used 10 cm cell culture plates and covered with silicon rubber | ||
| DMSO | Sigma | 472301-500ML | For making forskolin stock |
| Electrical recorder | TOA Electronics | PRR-5041 | Other equivalent electrical recorders are available commercially |
| Epithelial voltage clamp amplifier | Nihon Kohden | CEZ9100 | Other equivalent amplifiers are available commerically |
| filter paper, cut into squares | NA | NA | Punched with a 5 mm punch, used to hold intestinal preparation |
| fine forceps | Fast Gene | FG-B50476 | For blunt dissection of the muscle layer |
| Forskolin | Alomone Labs | F-500 | Make 10 mM stock in DMSO, final concentration will be 10 µM |
| HEPES | Sigma | H4034-1KG | |
| Indomethacin | Sigma | I7338-5G | Make a 1 mM stock in 21 mM NaHCO3, final concentration is 10 µM |
| K2HPO4 | Fujifilm Wako | 164-04295 | |
| KCl | Fujifilm Wako | 163-03545 | |
| KCl/calomel electrode | Asch Japan Co. | SCE-100 | |
| KH2PO4 | Kanto chemical | 32379-00 | |
| L(+)-Glutamine | Fujifilm Wako | 074-00522 | |
| MgCl2 | Fujifilm Wako | 135-00165 | |
| Mixed Gas (95% O2/5% CO2) | Shizuoka Oxygen Company | Used for bubbling Ringer solution and chambers when using Ringer solution | |
| NaCl | Fujifilm Wako | 191-01665 | |
| NaCl electrode | NA | NA | Handmade electrodes which require concentrated NaCl and Silver wire |
| NaHCO3 | Fujifilm Wako | 191-01305 | |
| O2 Gas | Shizuoka Oxygen Company | Used for bubbling chambers when using HEPES buffer | |
| parafilm | Bemis | PM-996 | Used to help seal Ussing chambers |
| pH meter | DKK-TOA Corp | HM-305 | HEPES buffer needs to be adjusted to pH 7.4 at 37 °C |
| pH meter electrode | DKK-TOA Corp | GST-5311C | |
| silicone rubber | Shinetsu Chemical | KE-12 | Used to fill dissection plates |
| silver wire | Used for making NaCl electrodes | ||
| Small jars w/ plastic lids | NA | NA | Use for NaCl electrodes |
| stereomicroscope | Zeiss | Stemi 305 | A stereomicroscope allows you to see depth, so you can dissect the tissue more easily |
| Tris (Trizma base) | Sigma | T1503-1KG | Make a 1M solution to adjust pH of HEPES buffers |
| Ussing chambers | Sanki Kagaku Kougei | These chambers are custom made continuous perfusion Ussing chambers with a window diameter of 5 mm | |
| Water pump and heating system | Tokyo Rikakikai Co. Ltd. | NTT-110 |
References
- Ussing, H. H., Zerahn, K. Active transport of sodium as the source of electric current in the short-circuited isolated frog skin. Acta Physiologica Scandinavica. 23, 110-127 (1951).
- Field, M. Ion transport in rabbit ileal mucosa. II. Effects of cyclic 3′, 5′-AMP. American Journal of Physiology – Legacy Content. 221, 992-997 (1971).
- Herrmann, J. R., Turner, J. R. Beyond Ussing’s chambers: contemporary thoughts on integration of transepithelial transport. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 310, 423-431 (2015).
- Ishizuka, N., et al. Luminal Na + homeostasis has an important role in intestinal peptide absorption in vivo. American Journal of Physiology – Gastorintestinal and Liver Physiology. 315, 799-809 (2018).
- Ikehara, O., et al. Subepithelial trypsin induces enteric nerve-mediated anion secretion by activating proteinase-activated receptor 1 in the mouse cecum. Journal of Physiological Sciences. 62, 211-219 (2012).
- Furuse, M. Molecular basis of the core structure of tight junctions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 002907 (2010).
- Tsukita, S., Tanaka, H., Tamura, A. The claudins: From tight junctions to biological systems. Trends in Biochemical Sciences. 44, 141-152 (2019).
- Li, B. R., et al. In vitro and in vivo approaches to determine intestinal epithelial cell permeability. Journal of Visual Experiments: JoVE. , e57032 (2018).
- Schoultz, I., Keita, &. #. 1. 9. 7. ;. V. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9, (2020).
- Yu, A. S. L., et al. Molecular basis for cation selectivity in claudin-2-based paracellular pores: Identifi cation of an electrostatic interaction site. Journal of General Physiology. 133, 111-127 (2009).
- Kimizuka, H., Koketsu, K. Ion transport through cell membrane. Journal of Theoretical Biology. 6, 290-305 (1964).
- Li, H., Sheppard, D. N., Hug, M. J. Transepithelial electrical measurements with the Ussing chamber. Journal of Cystic Fibrosis. 3, 123-126 (2004).
- Riordan, J. R., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: Cloning and characterization of complementary DNA. Science. 245, 1066-1073 (1989).
- Smith, J. J., Karp, P. H., Welsh, M. J. Defective fluid transport by cystic fibrosis airway epithelia. Journal of Clinical Investigation. 93, 1307-1311 (1994).
- Molinski, S. V., et al. Orkambi and amplifier co-therapy improves function from a rare CFTR mutation in gene-edited cells and patient tissue. EMBO Molecular Medicine. 9, 1224-1243 (2017).
- Kisser, B., et al. The Ussing chamber assay to study drug metabolism and transport in the human intestine. Current Protocols in Pharmacology. 77, 1-19 (2017).
- Östh, K. . The horizontal Ussing chamber method in studies of nasal drug delivery – Method Delopment and Applications Using Different Formulations. , (2002).
- Guo, P., et al. Study of penetration mechanism of labrasol on rabbit cornea by Ussing chamber, RT-PCR assay, Western blot and immunohistochemistry. Asian Journal of Pharmaceutical Sciences. 14, 329-339 (2019).
- Okabe, K., et al. Effect of Benzalkonium Chloride on transscleral drug delivery. Investigative Opthalmology & Visual Science. 46, 703 (2005).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
- Kozuka, K., et al. Development and characterization of a human and mouse intestinal epithelial cell monolayer platform. Stem Cell Reports. 9, 1976-1990 (2017).
- Tamura, A., et al. Megaintestine in claudin-15-deficient mice. Gastroenterology. 134, 523-534 (2008).
- Nakayama, M., Ishizuka, N., Hempstock, W., Ikari, A., Hayashi, H. Na+-coupled nutrient cotransport induced luminal negative potential and Claudin-15 play an important role in paracellular Na+ recycling in mouse small intestine. International Journal of Molecular Sciences. 21, 376 (2020).
- Tamura, A., et al. Loss of claudin-15, but not claudin-2, causes Na+ deficiency and glucose malabsorption in mouse small intestine. Gastroenterology. 140, 913-923 (2011).
- Clarke, L. L. A guide to Ussing chamber studies of mouse intestine. American Journal of Physiology – Gastrointestinal and Liver Physiology. 296, (2009).
- Dobson, J. G., Kidder, G. W. Edge damage effect in in vitro frog skin preparations. American Journal of Physiology. 214, 719-724 (1968).
- Corman, B. Streaming potentials and diffusion potentials across rabbit proximal convoluted tubule. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 403, 156-163 (1985).
- Shen, L., Weber, C. R., Raleigh, D. R., Yu, D., Turner, J. R. Tight junction pore and leak pathways: A dynamic duo. Annual Review of Physiology. 73, 283-309 (2011).
- Frizzell, R. A., Schultz, S. G. Ionic conductances of extracellular shunt pathway in rabbit ileum. Journal of General Physiology. 59, 318-346 (1972).
- Otani, T., et al. Claudins and JAM-A coordinately regulate tight junction formation and epithelial polarity. Journal of Cell Biology. 218, 3372-3396 (2019).
