Summary
在这里，我们描述了一个相关的工作流程的切除，加压，固定和成像的粘液肺瓣，以确定总构象和局部细胞外矩阵结构。
Abstract
心脏瓣膜相关疾病 （HVD） 的根本原因难以捉摸。Murine 动物模型为研究 HVD 提供了绝佳的工具，但是，在多个长度尺度上准确量化结构和组织所需的外科和器具专业知识阻碍了其发展。这项工作提供了详细的描述，以描绘不同长度尺度的心瓣膜解剖，集团染色，样品处理和相关成像程序。通过化学固定心脏瓣膜构象，用于控制时间异质性。微计算断层扫描 （μCT） 用于确认心脏瓣膜的几何形状，并为串行块面部扫描电子显微镜 （SBF-SEM） 所需的下游样品处理提供参考。拍摄了细胞外矩阵 （ECM） 的高分辨率序列 SEM 图像，并进行了重建，以提供其组织的本地 3D 表示。然后，将 μCT 和 SBF-SEM 成像方法关联在一起，以克服整个肺瓣的空间变化。虽然所介绍的工作完全在肺瓣上，但这种方法可以用来描述生物系统中的分层组织，并且对于跨多个长度尺度的结构特征至关重要。
Introduction
肺瓣膜 （PV） 用于确保右心室和肺动脉之间的单向血液流动。肺瓣膜畸形与几种形式的先天性心脏病有关。目前对先天性心脏瓣膜疾病（HVD）的治疗是瓣膜修复或瓣膜置换，这可能需要在患者一生中进行多次侵入性手术。人们普遍认为心脏瓣膜的功能来源于其结构，通常称为结构功能相关。更具体地说，心脏的几何和生物力学特性决定了心脏的功能。机械特性则由 ECM 的组成和组织决定。通过开发一种确定穆林心脏瓣膜生物力学特性的方法，转基因动物模型可用于质疑ECM在心脏瓣膜功能和功能障碍2、3、4、5中的作用。
长期以来，穆林动物模型一直被视为分子研究的标准，因为与其他物种相比，转基因模型在小鼠中更容易获得。穆林转基因模型为研究心脏瓣膜相关疾病提供了一个多功能的平台。然而，几何学和ECM组织的特点的外科专业知识和仪器要求一直是推进HVD研究的主要障碍。文献中的病理学数据提供了一张图到穆林心脏瓣膜细胞外矩阵的内容，但仅以2D图像的形式，无法描述其3D架构7，8。此外，心脏瓣膜在空间和时间上都是异质的，因此，如果取样和构造不是固定的，则很难在有关ECM组织的实验中得出结论。传统的 3D 定性方法，如 MRI 或 3D 声心动图，不提供解决 ECM 组件9、10所需的分辨率。
这项工作详细介绍了一个完全相关的工作流程，其中通过修复与静水性转腔压力的粘液光伏的构象来解决心脏循环引起的时间异质性问题。空间异质性通过对感兴趣的区域进行采样和从不同的成像方式（特别是 μCT 和串行块面部扫描电子显微镜）中注册数据集，在不同的长度尺度上精确控制。这种用 μCT 进行侦察以引导下游取样的方法以前曾被提出过，但由于肺瓣膜存在时间变化，因此在手术11级需要额外的控制水平。
在描述穆林心脏瓣膜生物力学的体内研究中，生物力学很少，相反，在描述变形行为时依赖于计算模型。纳米长度尺度上的局部细胞外数据与心脏瓣膜的几何形状和位置相关至关重要。这反过来又提供了可量化的、空间映射的机械贡献ECM蛋白分布，可用于强化现有的生物力学心脏瓣膜模型12、13、14。
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Protocol
本研究中动物的使用符合全国儿童医院机构动物护理和使用委员会根据AR13-00030协议。
1. 肺瓣切除
- 解密鼠标解剖所需的必要工具。这包括细剪刀、微钳子、微血管钳、夹子、微刀架、弹簧剪刀和缩回器。
- 手术前至少让所有小鼠适应2周。将C57BL/6小鼠（大约1岁）从笼子中取出并称重，然后用氯胺酮/西拉津鸡尾酒（3：1氯胺酮：西拉津，每克0.01ml）过量服用安乐死。
- 将鼠标放在托盘上的负位，用胶带固定其四肢。一旦固定，执行胸腔切除术。
- 通过去除任何多余的脂肪组织和筋膜来暴露心脏。
- 取出右中庭，用室温盐水溶液（0.9% NaCl）在左心室中灌注。灌注需要大约 20 mL 超过 30 秒。这会导致鼠标的排泄。
- 切除高级静脉卡瓦、劣质静脉卡瓦、肺动脉和主动脉，切除整个心脏。应特别注意肺动脉。在通风口-动脉交界处上方切割约2毫米，因为这将作为加压的导管。
- 取出左右心室，使腔室暴露在大气压力之下。确保肺干结构不受心室切除的影响。
2. 肺瓣膜压力固定
- 带肺动脉的麻醉加压管，在管状结和管末端之间留下约1毫米的距离，以适应传单和肺干的巨大运动。
- 将储层提升到类似的生理压力，并填充盐水溶液。测试流经系统，以确保没有堵塞或气泡。
- 将止损卡连接到血管造影肺瓣上，通过切换外流道确保管道（即无气泡）的充足流动。一旦流量充足，将流出开关到血管肺瓣，并确保肺干加压。这是通过肺干消散来识别的。
- 一旦肺干加压得到确认，逐步采用原固定溶液（1.25%谷胱甘肽，1.0%的甲醛在0.15M可可二甲酸酯），直到盐水溶液被清除。这是通过去除盐水溶液的一部分（约占储层容量的 25%），并将其替换为主要固定剂来完成的。
注意事项：使用的固定剂（副甲醛和谷胱甘肽）是剧毒的，应佩戴适当的个人防护设备（PPE），以确保安全。 - 在组织样品上放置固定浸泡纱布，以防止干燥。
- 将固定剂香水敷料 3 小时，根据需要重新填充储层以保持恒定压力。在整个固定过程中，肺瓣膜因化学固定而收缩的情况并不少见。如果是这样的话，不断补充水库的主要固定，以保持生理压力。
- 将心脏瓣膜存放在 4 °C 的固定溶液中，直到使用。样品存储长达1周，没有任何明显的差异。
3. 恩集团样品染色和嵌入15，16
警告：本节中使用的染色试剂（铁氰化钾、四氧化二甲酸酯、硫碳水化合物、阿斯巴酸盐铅和醋酸尿素）具有剧毒性，应极其小心地处理。建议使用烟气罩和适当的 PPE。
- 染色
- 用冷0.15 M可可二甲酸酯缓冲器清洗固定心脏瓣膜样本5分钟。再重复洗两次。
- 将心脏瓣膜完全浸入1.5%的铁氰化钾、0.15M可可硅酸盐、2mM氯化钙和2%四氧化硫溶液中，在冰上浸泡1小时。
- 当样品孵育时，将溶解 0.1 克 TCH 溶解在 10 mL 的 ddH2O 中，将溶液放入 60 °C 烤箱中 1 小时，准备硫碳水化合物 （TCH） 溶液。定期轻轻搅拌，以确保TCH完全溶解。使用前立即通过 0.22 μm 注射器过滤器过滤解决方案。
- 将样品放在 ddH2O 管中 5 分钟，然后摇动容器，用室温 ddH2O 清洗样品。重复此过程三次。
- 在室温下将其放到过滤的 TCH 溶液中 20 分钟。按照步骤 3.1.4 中描述的室温 ddH 2 O 执行三次（每次5分钟）洗涤步骤。
- 完成后，将样品放在 2% 的四氧化硫中，在室温下放置 30 分钟。然后用室温 ddH2O 再洗三次，每次 5 分钟。
- 在 4 °C 下将样品在 1% 的醋酸尿素中孵育过夜。
- 在此期间，在10mL的阿斯酸库存溶液中，制作0.066克硝酸铅溶液。调整 pH 值至 5.5 与 1 N KOH。将溶液放入 60 °C 烤箱中溶解硝酸铅。
- 隔夜孵化后，按照第 3.1.4 步的描述执行洗涤步骤。重复三次。然后，在 60 °C 烤箱中将心脏瓣膜组织从第 3.1.8 步开始，在铅阿斯巴酸盐溶液中孵育 30 分钟。
- 脱水
- 在室温下用 ddH2O 清洗组织 5 分钟，重复三次。
- 在 ddH2O 中制作 20%、50%、70%、90% 和 100% 乙醇的新解决方案，在冰上保持直到使用。
- 使心脏瓣膜组织脱水。在冰上分别进行20%、50%、70%和90%乙醇的后续治疗，每次5分钟。然后在冰上进行两次100%乙醇的后续治疗，为期5分钟。
- 将组织移至冰冷丙酮10分钟。然后在室温下放上新鲜丙酮10分钟。
- 嵌入
- 根据制造商的规格制作树脂混合物（见 材料表）：11.4 克 A 组件、10 克 B 组件、0.3 克成分 C 和 0.05-0.1 克组件 D。最初混合组件 A 和 B，将每个组件加热到 60 °C，然后添加组件 C 和 D。添加组件 C 和 D 后，混合物将变成琥珀色。适当混合时，将均匀。
- 制作体积比为 25：75、50：50 和 75：25 树脂：丙酮的混合物。彻底混合。
- 将组织放在随后的治疗中，在室温下分别处理25：75、50：50和75：25树脂：丙酮混合物2小时。
- 在室温下将组织放在100%树脂中过夜。
- 第二天，在室温下将组织放在新鲜的100%树脂中2小时。
- 将心脏瓣膜组织转移到嵌入胶囊中，用新鲜的 100% 树脂替代，并放入 60 °C 烤箱中 48 小时进行治疗。
- 执行如下所示的相关成像。
4. 微计算断层成像
- 用胶粘剂将树脂样品块安装到 μCT 样品支架上（胶水或双面胶带效果良好）。
- 将支架放入 μCT 腔室，然后拧紧夹板将其固定在舞台上，这样支架就没有动静。扫描过程中的样品运动会降低图像质量。
- 通过双击图标打开 μCT 用户界面。通过选择项目旁边的 + 符号来添加 项目 ，并填写必要的字段。
- 创建后，查找创建的项目，然后单击它进行选择。这将打开第二列收购。选择收购旁边的 +并填写必要的字段。
- 通过按下前面板或 μCT 上的臂按钮来关闭室门并武装系统。通过选择表示 预热的按钮，从用户界面进行预热 X 光检查。
注：系统将在成功的热身手术后自动关闭 X 光片。通过选择按钮打开 X 光片。 - 调整阶段旋转，使样品旋转的中心不会偏离监视器的中心（即样品在整个扫描的视野内）。对于此实验中使用的系统，这涉及到在下方详细的下拉选项卡下调整感兴趣区域 （ROI） 阶段。
- 通过将旋转角度设置为 0° 并标记示例边缘来设置 ROI 阶段调整。然后将样品旋转到 180°，并再次标记样品的边缘。
- 调整投资回报率阶段 x 轴位置，使样品的边缘在这两个极端之间。对于 y 位置的旋转角度为 90° 和 270° 重复此过程。
- 如果样品的旋转导致边缘移出视野，则减少 μCT 需求的放大倍数，直到以上述设定角度可见样本的边缘，并可以进行粗糙的投资回报率阶段调整。
- 一旦在较低的放大倍率调整，移动样品或探测器，以增加放大倍率和投资回报率位置可以精细调整。
注：此过程可能需要重复，以确保对齐。适当的对齐结果在样品中显示很少或根本没有水平运动通过所有样品旋转角度。
- 使用制造商的软件调整 μCT 以达到所需的扫描参数。这些参数包括管电位、管电流、探测器距离、样本距离、暴露时间、轨迹和投影数量（请参阅本研究中使用的 μCT 采集参数表 S1）。
注：校准参数（如清晰场和暗场扫描）应保持在制造商的规格，除非另有说明。例如，如果样本太大，系统无法将样品移出现场视图，则需要删除样本以执行清晰的现场校准扫描。 - 设置参数后，可以通过按 下时间估计 按钮来观察扫描持续时间的近似值。选择 "开始" 按钮以开始扫描。
- 扫描完成后，确保关闭 X 射线，拧开小木屋，并小心地从 μCT 室中取出样品。
5. 样品处理与图像相关性
- 使用制造商提供的软件使用过滤的背面投影算法重建 μCT 投影（参见 材料表）。
- 选择屏幕顶部的 Recon 选项卡。选择 项目 和 收购 选项卡。
- 选择与过滤后投影相关的重新构想模板。按下 "开始"重合 按钮。
- 使用图像处理软件识别和分割肺瓣。这需要事先了解肺瓣膜17的解剖学。在高架动脉压力下，传单会合体并阻塞肺瓣的流明。
- 确定扫描方向和样品的切片方向。重新定位样品，使切片方向与所需的轴对齐。
- 确定高分辨率成像感兴趣的区域。在这个实验中，选择了传单的腹部（中间）和动脉-瓦尔维拉交界处。
- 去除多余的树脂，用剃须刀刀片或砂光取样，以获得大块材料，或用微原子取样，以取出更细的树脂。
- 一旦到达感兴趣的位置，将物理标本与虚拟 μCT 切片进行比较以确认位置。这是通过比较横截面的解剖特征来完成的。
6. 串行块面部扫描电子显微镜18
- 减少标本的横截面，以适应 SBF-SEM，约 2.0 x 1.5 x 1.8 mm。
- 使用环氧树脂将修剪过的样品安装到 SBF-SEM 铝存根上。
- 用 35 纳米黄金涂抹标本块。在平台上旋转样品以涂抹均匀的涂层。
- 通风 SBF-SEM 室，将刀刃的高度调整为显微镜欧心高度。
- 插入样品并平放样本存根。
- 低真空条件下的图像，以防止充电和反散射探测器（请参阅 表 S2 的 SBF-SEM 采集参数）。
- 使用自动化软件在不同的放大倍数下对多个感兴趣的区域进行图像和拼接（参见 材料表）。
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Representative Results
压管肺动脉的肺结膜病见图1A。在应用静水压力后，肺干会径向分散（图1B），表明肺瓣膜处于封闭配置中。肺瓣膜构造通过 μCT 确认。在这种情况下，传单是小品（封闭的），年鉴是圆形的（图2A）。图2B、C通过固定（图2B）或动脉塌陷（图2C）显示肺瓣加压不足程度不一。
样品块修剪由 μCT 卷渲染引导。在这种情况下，选择与中管交界处平行的平面作为切片方向。使用解剖地标，μCT 卷渲染虚拟横截面与光学图像 （图 3）相关，以确认切片方向和位置。
一旦标本块位于所需的位置和方向，在传单中的局部区域拍摄了高分辨率 SBF-SEM 图像。图像相关性是在 μCT 卷渲染虚拟切片 （图 4A）、低分辨率 SBF-SEM 图像 （图 4B）和高分辨率 SBF-SEM 图像 （图 4C）之间完成的。由于手动样品安装，在获取 SBF-SEM 中的图像之前，需要标本块的必需切片来创建平面：因此，图3和图4之间的不同位置。
μCT 和 SBF-SEM 数据集之间的完整图像相关性可在 视频 1中看到。由于重金属原子的染色，从周围嵌入树脂中很容易分辨出 μCT 体积渲染中的肺瓣标本。长度和角度在图像中测量，以引导切片。在此示例中，使用了与中管交界处平行的平面。虚拟切片通过模拟材料的删除，直到达到兴趣的深度。SBF-SEM 拍摄的高分辨率图像在此横截面拍摄并注册到 μCT 数据集。
获得后，SBF-SEM 拍摄的高分辨率图像可以导入图像处理器，并编译成 3D 表示 （图 5），在那里可以识别细胞外组件。
图1：肺干血管瘤代表图像。 水静压加压前（A）和（B）前切除的肺干。虚线表示肺干环流所在的静脉-动脉结。注意加压时的肺干消压。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：代表的μCT体积渲染肺瓣膜。 （A） 肺瓣处于封闭位置，传单充分拉伸和紧贴（圆）。（B，C）肺瓣加压不足。请注意，传单没有正确编码（B），环形不是圆形的（C）。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：肺瓣标本块的图像相关性。 （A） 光学显微镜修剪后，μCT 体积渲染虚拟切片和（B） 物理标本块。肺瓣叶片部分以红色圆圈，用作地标，将两种不同的成像方法关联在一起。刻度条对应于 500 μm。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：图像肺瓣横截面的图像相关性。 （A） 由 μCT 卷渲染生成的虚拟横截面。红框表示使用 SBF-SEM 在（B）中成像的区域。（B） 低分辨率概述图像与 μCT 横截面相关联。蓝色框表示（C）高分辨率 SBF-SEM 成像的位置。刻度条对应于（B） 100 μm 和（C） 10 μm。 请单击此处查看此图的较大版本。
图5：SBF-SEM拍摄的肺瓣的分段区域。 堆叠和汇编了横截面图像，形成局部肺瓣区域的 3D 表示。标签被分配到内皮细胞（绿色）、瓦尔维拉间间细胞（蓝色）和细胞外纤维（黄色）。图像区域的大致尺寸为 30 μm x 20 μm x 100 μm。 请单击此处查看此图的较大版本。
| 管潜力 | 70千伏 |
| 管电流 | 75 μA |
| 对焦模式 | M |
| 弹道 | 循环 |
| 预测/革命 | 2880 |
| 模式 | 3040 x 3040 px |
| 平均 | 1 |
| 曝光时间 | 1.0 s |
| 样品到枪的距离 | 15 毫米 |
| 探测器到枪的距离 | 725 毫米 |
| 沃克塞尔大小 | 2.9 μm |
| 视野 | 8.4 x 8.4 x 6.3 毫米 |
表 S1：μCT 的成像参数。
| 着陆能量 | 2 - 2.5千伏 |
| 光束电流 | 100 - 400 pA |
| 工作距离 | 6.5 - 7 毫米 |
| 探测器 | VS-DBS |
| 居住时间 | 1 - 2 μs |
表 S2：SBF-SEM 的成像参数。
视频 1：μCT 和 SBF-SEM 数据集的图像校正。请点击这里下载此视频。
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Discussion
切除心室有两个目的。首先，将心室侧暴露在大气压力之下，因此只需要从肺瓣的动脉侧施加转腔压力来关闭：其次，提供一个稳定的基座，以防止肺干扭动。在加压过程中，肺干径向和低劣地分散，容易扭动，导致肺干坍塌。用盐水溶液预装肺瓣膜可以进行额外的质量检查，以确保加压充足，并且系统中是否存在泄漏。主固定剂的动作速度很快，大约几秒钟，无需用盐水溶液进行静水预装，肺瓣膜将随机构象固定。在没有预装的情况下，封闭式肺瓣的成功率约为10%-20%。通过预装步骤，成功率超过 90%。
为此应用程序调整了 μCT 和 SBF-SEM 成像条件。肺瓣，当完全拉伸时，可以小于10μm厚。根据经验，能够解析一个功能需要 3 个 voxels 的阈值：因此，μCT 卷渲染的扫描尺寸为 2.9 μm，视野为 8.4 x 8.4 x 6.3 mm。较小的 voxel 尺寸可以在 μCT 中实现，但这需要样品修剪和/或更长的扫描时间。较小的样品将使其更接近 X 射线源，从而获得更高的分辨率。也可以通过将 X 射线探测器放置在离样品较远的位置来实现更小的 voxels;然而，这将减少探测器的总通量，并损害信号与噪声比。作为参考，我们的 μCT 扫描持续时间约为 5-6 小时。本研究中使用的特定成像条件位于补充表 S1和辅助表 S2中。
此方法有局限性。此程序的手术部分需要动物处理方面的专业知识，以便在处理过程中不损害肺瓣膜结构。此外，成像是时间密集型的，需要多个成像仪器。作为参考，高分辨率 SBF-SEM 成像大约为 100 μm 的连续成像 1 周。对于仪器来说，在长时间的成像训练中保持稳定和一致是一项艰巨的任务。更实际的方法是设计一个采样策略，在没有时间投资的情况下精确描绘肺瓣膜的异质性。这还有待确定。迄今为止，整个相关工作流已在一只鼠标上完成，但在调查跨长度尺度的肺瓣时，已显示出相关工作流的可行性和潜力。
这种相关方法的未来迭代可能涉及 原位 μCT 实验，以便同一样本可能暴露在不同的跨谷体压力下，以消除样品对样品的变异。目前，由于水和组织的衰减系数相似，样品和仪器在延长扫描时间、集成成像系统的加压仪器以及对比度方面受到限制。此外，虽然转角压力反映了生理条件，但它并不代表心脏收缩特征的脉动流动。然而，已经表明，应变率对传单的构象影响不大。在未来的迭代中，它可能证明更相关的工程设备能够管理脉冲流9。此外，大部分工作需要人工询问样本，因为目前没有自动工作流程。将肺瓣定位、样品处理到感兴趣的区域、图像相关性和注册都是手动完成的，但将来将证明有助于简化处理并降低主观性。
所介绍的工作是修复肺瓣膜构造和在 μCT 和 SBF-SEM 中注册成像的相关工作流程。使用这种方法获得的信息最终将用于确定在穆林动物模型中肺瓣的基本生物力学，这些尚未阐明。Valvular 生物力学可以通过其几何学和细胞外矩阵来完全描述，但它们具有两种不同的长度尺度。为此，需要精确控制阀门的异质性，并准确映射细胞外基质的高分辨率图像，以了解其在肺瓣内的位置。这种相关的工作流程已经被实施到其他实验中，以比较野生型和转基因骨生成不完美的小鼠，以比较纤维细胞外基质的差异，并很容易推断出其他先天缺陷，如双丘瓣膜形成19，20。这些信息加上可能的蛋白酶学将提供两种穆林动物模型之间生物力学差异的完整图景。
尽管这项工作只描绘了肺瓣膜，但这种工作流程很容易被其他异质的分层生物系统所修正。我们利用 3D 成像技术来捕捉 ECM 的架构组织，但更高的分辨率技术，如传输电子显微镜或扫描传输电子显微镜，可以根据所需的信息进行附加。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作部分得到了 R01HL139796 和 R01HL128847 赠款的支持，这些赠款用于 CKB 和 RO1DE028297 以及 DWM 的 CBET1608058。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25% glutaraldehyde (aq) | EMS | 16210 | Primary fixative component |
| 0.9% sodium chloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 10 mL syringe | BD | 309604 | |
| 200 proof ethanol | EMS | 15055 | |
| 22G needle | BD | 305156 | |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | |
| 3-way stopcock | Smiths Medical ASD, Inc. | MX5311L | |
| 4% osmium tetroxide | EMS | 19150 | Staining component |
| 4% paraformaldehyde (aq) | EMS | 157-4-100 | Primary fixative component |
| Absorbable hemostat | Ethicon | 1961 | |
| Acetone | EMS | 10012 | |
| Black polyamide monofilament suture, 10-0 | AROSurgical instruments Corporation | TI38402 | |
| Black polyamide monofilament suture, 6-0 | AROSurgical instruments Corporation | SN-1956 | |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratories | 664 | Approximately 1 yo |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| Clamp applying forcep | FST | 00072-14 | |
| Cotton tip applicators | Fisher Scientific | 23-400-118 | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Dumont #5 forcep | FST | 11251-20 | |
| Dumont #5/45 forceps | FST | 11251-35 | |
| Dumont #7 fine forcep | FST | 11274-20 | |
| Durcupan ACM resin | EMS | 14040 | For embedding |
| Fine scissor | FST | 14028-10 | |
| Heliscan microCT | Thermo Fisher Scientific | Micro-CT | |
| Ketamine hydrochloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| L-aspartic acid | Sigma-Aldrich | 56-84-8 | Staining component |
| Lead nitrate | EMS | 17900 | Staining component |
| low-vacuum backscatter detector | Thermo Fisher Scientific | VSDBS | SEM backscatter detector |
| Micro-adson forcep | FST | 11018-12 | |
| Millex-GP filter, 0.22 um, PES 33mm, non-sterile | EMD Millipore | SLGP033NS | |
| Non-woven songes | McKesson Corp. | 94442000 | |
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | Sigma-Aldrich | 14459-95-1 | Staining component |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 | |
| Pressure monitor line | Smiths Medical ASD, Inc. | MX562 | |
| Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride) | Hospira Inc. | NDC 0409-0138-22 | |
| Size 3 BEEM capsule | EMS | 69910-01 | Embedding container |
| Sodium cacodylate trihydrate | Sigma-Aldrich | 6131-99-3 | Buffer |
| Solibri retractors | FST | 17000-04 | |
| Sputter, carbon and e-beam coater | Leica | EM ACE600 | Gold coater |
| Surgical microscope | Leica | M80 | |
| Thiocarbohydrazide (TCH) | EMS | 21900 | Staining component |
| Tish needle holder/forcep | Micrins | MI1540 | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400 | Staining component |
| Volumescope scanning electron microscope | Thermo Fisher Scientific | VOLUMESCOPESEM | Serial Block Face Scanning Electron Microscope |
| Xylazine sterile solution | Akorn Inc. | NADA# 139-236 |
References
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