Summary
Her beskriver vi en korrelativ arbeidsflyt for eksisjon, trykk, fiksering og avbildning av murinpulmonalventilen for å bestemme bruttokonformasjonen og lokale ekstracellulære matrisestrukturer.
Abstract
De underliggende årsakene til hjerteklaffrelatert sykdom (HVD) er unnvikende. Murine dyremodeller gir et utmerket verktøy for å studere HVD, men den kirurgiske og instrumentelle ekspertisen som kreves for å nøyaktig kvantifisere strukturen og organisasjonen på tvers av flere lengdeskalaer, har hindret utviklingen. Dette arbeidet gir en detaljert beskrivelse av murin disseksjon, en blokkfarging, prøvebehandling og korrelative bildebehandlingsprosedyrer for fremstilling av hjerteklaffen i forskjellige lengdeskalaer. Hydrostatisk transvalvulært trykk ble brukt til å kontrollere den tidsmessige heterogeniteten ved kjemisk å fikse hjerteklaffkonformasjonen. Mikro-beregnet tomografi (μCT) ble brukt til å bekrefte geometrien til hjerteklaffen og gi en referanse for nedstrøms prøvebehandling som trengs for seriell blokk ansiktsskanning elektronmikroskopi (SBF-SEM). Høyoppløselige serielle SEM-bilder av den ekstracellulære matrisen (ECM) ble tatt og rekonstruert for å gi en lokal 3D-representasjon av organisasjonen. μCT- og SBF-SEM-avbildningsmetoder ble deretter korrelert for å overvinne den romlige variasjonen på tvers av lungeventilen. Selv om arbeidet som presenteres utelukkende er på lungeventilen, kan denne metoden vedtas for å beskrive den hierarkiske organisasjonen i biologiske systemer og er avgjørende for strukturell karakterisering på tvers av flere lengdeskalaer.
Introduction
Lungeventilen (PV) tjener til å sikre enveis blodstrøm mellom høyre ventrikel og lungearterien. Lungeklaff misdannelser er forbundet med flere former for medfødt hjertesykdom. Den nåværende behandlingen for medfødt hjerteklaffsykdom (HVD) er valvulær reparasjon eller ventilutskifting, noe som kan nødvendiggjøre flere invasive operasjoner gjennom pasientens levetid1. Det har blitt allment akseptert at hjerteklaffens funksjon er avledet fra strukturen, ofte referert til som strukturfunksjonen korrelerer. Mer spesifikt dikterer hjertets geometriske og biomekaniske egenskaper sin funksjon. De mekaniske egenskapene bestemmes i sin tur av sammensetningen og organiseringen av ECM. Ved å utvikle en metode for å bestemme de biomekaniske egenskapene til murine hjerteklaffer, kan transgene dyremodeller brukes til å forhøre ECM-rollen på hjerteklafffunksjon og dysfunksjon2,3,4,5.
Murindyrmodellen har lenge vært ansett som standarden for molekylære studier fordi transgene modeller er lettere tilgjengelige hos mus sammenlignet med andre arter. Murine transgene modeller gir en allsidig plattform for forskning av hjerteklaffrelaterte sykdommer6. Imidlertid har de kirurgiske kompetanse- og instrumenteringskravene for å karakterisere både geometrien og ECM-organisasjonen vært et stort hinder for å utvikle HVD-forskning. Hstologiske data i litteraturen gir et bilde i murin hjerteklaff ekstracellulært matriseinnhold, men bare i form av 2D-bilder, og kan ikke beskrive sin 3D-arkitektur7,8. I tillegg er hjerteklaffen både romlig og tidsmessig heterogen, noe som gjør det vanskelig å trekke konklusjoner på tvers av eksperimenter angående ECM-organisering hvis prøvetaking og konformasjon ikke er løst. Konvensjonelle 3D-karakteriseringsmetoder, for eksempel MR- eller 3D-ekkokardiografi, gir ikke den nødvendige oppløsningen for å løse ECM-komponenter9,10.
Dette arbeidet beskriver en fullstendig korrelativ arbeidsflyt der den tidsmessige heterogeniteten på grunn av hjertesyklusen ble adressert ved å fikse konformasjonen av murin PV med hydrostatisk transvalvulært trykk. Den romlige heterogeniteten ble kontrollert nettopp av prøvetakingsregioner av interesse og registrering av datasett fra forskjellige bildemodaliteter, spesielt μCT og seriell blokk ansiktsskanning elektronmikroskopi, på tvers av forskjellige lengdeskalaer. Denne metoden for speiding med μCT for å lede nedstrøms prøvetaking er foreslått tidligere, men fordi lungeventilen viser tidsvariasjon, var det nødvendig med et ekstra kontrollnivå på kirurgisk nivå11.
In vivo-studier som beskriver murin hjerteklaffbiomekanikk er sparsommelige og er i stedet avhengige av beregningsmodeller når de beskriver deformasjonsatferden. Det er av avgjørende betydning at lokale ekstracellulære data på nanometerlengdeskalaen er relatert til geometrien og plasseringen av hjerteklaffen. Dette gir i sin tur kvantifiserbare, romlig kartlagte distribusjoner av mekanisk medvirkende ECM-proteiner, som kan brukes til å forsterke eksisterende biomekaniske hjerteklaffmodeller12,13,14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bruken av dyr i denne studien var i samsvar med Landsdekkende Barnesykehus institusjonelt dyrepleie- og bruksutvalg i henhold til protokoll AR13-00030.
1. Pulmonal ventil eksisjon
- Autoklaver de nødvendige verktøyene som trengs for museredhandlingen. Dette inkluderer fin saks, mikro tang, mikrovaskulære klemmer, klemme påføring tang, mikroneedle holdere, vår saks og retraktorer.
- Akklimatisere alle mus i minst 2 uker før operasjonen. Fjern C57BL/6 mus, ca. 1 år, fra burene og vei, og avlys deretter med en ketamin/xylazincocktail (3:1 ketamin:xylazine, 0,01 ml per g) overdose.
- Plasser musen i en dorsal recumbence posisjon på et brett og sikre lemmer med tape. Når den er sikret, utfør thoracotomy.
- Utsett hjertet ved å fjerne overflødig fettvev og fascia.
- Fjern høyre atrium og perfuse gjennom venstre ventrikel med romtemperatur saltløsning (0,9% NaCl). Perfusjonen skal ta ca. 20 ml over 30 s. Dette resulterer i ekssanguinasjon av musen.
- Fjern hele hjertet ved å kutte den overlegne vena cava, dårligere vena cava, lungearterie og aorta. Spesiell forsiktighet bør tas for lungearterien. Klipp ca. 2 mm over det ventriculo-arterielle krysset, da dette vil fungere som kanal for trykksetting.
- Fjern venstre og høyre ventrikler for å eksponere kamre for atmosfærisk trykk. Pass på at strukturen på lungestammen ikke skal påvirkes ved fjerning av ventriklene.
2. Trykkfiksering av lungeventil
- Anastomose trykkslange med lungearterie, og etterlater ca 1 mm avstand mellom sino-rørformede krysset og enden av slangen for å imøtekomme store bevegelser av brosjyrene og lungestammen.
- Løft reservoaret til et analogt fysiologisk trykk og fyll det med saltoppløsningen. Test gjennomstrømningssystemet for å sikre at det ikke er blokkeringer eller luftbobler.
- Fest en stoppekran til den anastomoserte lungeventilen og sørg for tilstrekkelig strømning gjennom slangen (dvs. ingen luftbobler) ved å bytte utløpskanalen. Når strømmen er tilstrekkelig, bytt utløpet til den anastomosed lungeventilen og sørg for trykkavlastning av lungestammen. Dette er identifisert av lungestamme distention.
- Når trykksettingen av lungestammen er bekreftet, inkorporerer gradvis primær fixativ løsning (1,25% glutaraldehyd, 1,0% paraformaldehyd i 0,15 M kaktokylat) til saltoppløsningen er renset. Dette gjøres ved å fjerne en del, ca. 25% av reservoarkapasiteten, av saltoppløsningen og erstatte den med det primære fikseringsmiddelet.
FORSIKTIG: Festemidler som brukes (paraformaldehyd og glutaraldehyd) er svært giftige og passende personlig verneutstyr (PVU) bør brukes for å sikre sikkerhet. - Plasser en fixative-gjennomvåt gasbind over vevsprøven for å forhindre tørking.
- Perfuse fikseringsmiddelet i 3 timer, påfyll reservoaret etter behov for å opprettholde et konstant trykk. Gjennom fiksering er det ikke uvanlig at lungeventilen krymper på grunn av kjemisk fiksering. Hvis dette er tilfelle, fyll hele tiden reservoaret med primært fikseringsmiddel for å opprettholde fysiologisk trykk.
- Oppbevar hjerteklaffen i fikseringsløsningen ved 4 °C til bruk. Prøver ble lagret i opptil 1 uke uten merkbar forskjell.
3. En blokk prøve farging og innebygging15,16
FORSIKTIG: Fargingsreagensene som brukes i denne delen (kaliumferocyanid, osmium tetroksid, tiokarbohydrazid, bly aspartat og uranylacetat) er svært giftige og bør håndteres med stor forsiktighet. Bruk av avtrekkshette og riktig verneutstyr anbefales.
- Flekker
- Vask den faste hjerteklaffprøven i 5 minutter med kald 0,15 M kaktokylatbuffer. Gjenta vasken to ganger til.
- Senk hjerteklaffen helt ned i en løsning på 1,5% kaliumferocyanid, 0,15 M kaktoksylat, 2 mM kalsiumklorid og 2% osmiumtyroksid, på is i 1 time.
- Mens prøven inkuberer, klargjør du tiokarbohydrazid (TCH)-oppløsning ved å oppløse 0,1 g TCH i 10 ml ddH2O. Plasser oppløsningen i en 60 °C ovn i 1 time. Rør forsiktig med jevne mellomrom for å sikre at TCH er oppløst helt. Filtrer oppløsningen gjennom et 0,22 μm sprøytefilter umiddelbart før bruk.
- Vask prøvene med romtemperatur ddH2O ved å plassere dem i et rør med ddH2O i 5 min og rør det litt ved å riste beholderen. Gjenta denne prosessen tre ganger.
- Plasser den i filtrert TCH-oppløsning i 20 min ved romtemperatur. Utfør vasketrinnet tre ganger (5 min hver) med romtemperatur ddH2O som beskrevet i trinn 3.1.4.
- Når du er ferdig, plasser prøven i 2% osmium tetroxide i 30 min ved romtemperatur. Vask den deretter igjen i totalt tre ganger i 5 min hver med romtemperatur ddH2O.
- Inkuber prøven i 1% uranylacetat over natten ved 4 °C.
- I løpet av denne tiden, lag en løsning på 0,066 g blynitrat i 10 ml aspartinsyre lagerløsning. Juster pH til 5,5 med 1 N KOH. Plasser oppløsningen i en 60 °C ovn for å oppløse blynitrat.
- Etter overnatting inkubasjon, utfør vasketrinnet som beskrevet i trinn 3.1.4. Gjenta tre ganger. Deretter inkuberer du hjerteklaffvevet i bly aspartatoppløsning fra trinn 3.1.8 i en 60 °C ovn i 30 minutter.
- Dehydrering
- Vask vevet i 5 min ved romtemperatur med ddH2O. Gjenta tre ganger.
- Lag nye løsninger på 20%, 50%, 70%, 90% og 100% etanol i ddH2O. Hold på is til bruk.
- For å dehydrere hjerteklaffvevet. Utfør etterfølgende behandlinger på 20%, 50%, 70% og 90% etanol på is i 5 min hver. Utfør deretter to påfølgende behandlinger av 100% etanol på is i 5 min.
- Flytt vevet til iskald aceton i 10 min. Plasser deretter i fersk aceton ved romtemperatur i 10 min.
- Innebygging
- Lag harpiksblandingen (se Materialliste) i henhold til produsentens spesifikasjoner: 11,4 g komponent A, 10 g komponent B, 0,3 g komponent C og 0,05-0,1 g komponent D. Bland først komponentene A og B ved å varme opp hver av komponentene til 60 °C før du tilsetter komponentene C og D. Blandingen blir til en gul farge ved tilsetning av komponenter C og D. Det vil være jevnt når det blandes riktig.
- Lag blandinger med volumforhold på 25:75, 50:50 og 75:25 harpiks:aceton. Bland grundig.
- Plasser vev i etterfølgende behandlinger av 25:75, 50:50 og 75:25 harpiks:acetonblanding i 2 timer hver ved romtemperatur.
- Plasser vev i 100% harpiks over natten ved romtemperatur.
- Neste dag legger du vev i frisk 100% harpiks i 2 timer ved romtemperatur.
- Overfør hjerteklaffvevet til en innbyggingskapsel, erstatt med frisk 100% harpiks, og legg i en 60 ° C ovn i 48 timer for å kurere.
- Utfør korrelativ avbildning som vist nedenfor.
4. Mikro-beregnet tomografiavbildning
- Monter harpiksprøveblokken på en μCT-prøveholder med lim (lim eller dobbeltsidig tape fungerer bra).
- Plasser holderen i μCT-kammeret og fest den på scenen ved å skru spennhylsen slik at det ikke er noen bevegelse av holderen. Eksempelbevegelser under skanningen vil redusere bildekvaliteten.
- Åpne μCT-brukergrensesnittet ved å dobbeltklikke på ikonet. Legg til et prosjekt ved å velge +-tegnet ved siden av Prosjekter og fylle ut de nødvendige feltene.
- Når dette er opprettet, finn det opprettede prosjektet, og velg det ved å klikke på det. Dette åpner en ny kolonne Anskaffelser. Velg + ved siden av Anskaffelser, og fyll ut de nødvendige feltene.
- Lukk kammerdørene og armer systemet ved å trykke på armeringsknappen på frontpanelet eller μCT. Varm opp røntgenbilder fra brukergrensesnittet ved å velge knappen som indikerer Oppvarming.
MERK: Systemet slår automatisk av røntgenbildene etter en vellykket oppvarmingsprosedyre. Slå på røntgenbilder ved å velge knappen. - Juster trinnrotasjonen slik at midten av rotasjonen av prøven ikke avviker fra midten av skjermen (dvs. prøven er innenfor synsfeltet for hele skanningen). For systemet som brukes til dette eksperimentet, innebærer dette å justere interesseområdet (ROI) under rullegardinmenyen som beskrevet nedenfor.
- Still inn ROI-trinnjusteringen ved å sette rotasjonsvinkelen til 0° og markere kanten på prøven. Prøven roteres deretter til 180°, og kanten på prøven merkes på nytt.
- Juster ROI stage x-akseposisjonen slik at kanten av prøven er mellom disse to ytterpunktene. Gjenta denne prosessen for rotasjonsvinkler på 90° og 270° for y-posisjon.
- I tilfelle der rotasjonen av prøven fører til at kantene beveger seg ut av synsfeltet, reduserer du forstørrelsen av μCT-behovene til kantene på prøven er synlige i de ovennevnte angitte vinklene, og en grov ROI-trinnjustering kan gjøres.
- Når prøven eller detektoren er justert med lavere forstørrelse, for å øke forstørrelsen og avkastningen kan finjusteres.
MERK: Denne prosessen må kanskje gjentas for å sikre justering. Riktig justering resulterer i en prøve som viser liten eller ingen horisontal bevegelse gjennom alle prøverotasjonsvinkler.
- Juster μCT til ønskede skanneparametere ved hjelp av produsentens programvare. Disse parametrene inkluderer rørpotensial, rørstrøm, detektoravstand, prøveavstand, eksponeringstid, bane og antall fremskrivninger (se tabell S1 for μCT-anskaffelsesparametrene som brukes i denne studien).
MERK: Kalibreringsparametere, for eksempel klare felt- og mørkefeltskanninger, bør oppbevares etter produsentens spesifikasjoner med mindre annet er oppgitt. Hvis for eksempel en prøve er for stor og systemet ikke kan flytte prøven ut av feltvisningen, må prøven fjernes for å utføre klare feltkalibreringssøk. - Når parametrene er stilt inn, kan du se en tilnærming av skanningens varighet ved å trykke på Tidsestimat-knappen. Velg Start for å starte skanningen.
- Etter at skanningen er fullført, må du kontrollere at røntgenbildene er slått av, skru av spennhylsen og fjern prøven forsiktig fra μCT-kammeret.
5. Prøvebehandling og bildekorrelasjon
- Rekonstruer μCT-projeksjoner ved hjelp av en filtrert bakprojeksjonsalgoritme med programvaren fra produsenten (se Materialliste).
- Velg kategorien Rekognoser øverst på skjermen. Velg kategorien Prosjekt og anskaffelse.
- Velg rekognoseringsmalen som er knyttet til filtrert bakprojeksjon. Trykk på Start Recon-knappen.
- Identifiser og segmenter lungeventilen ved hjelp av bildebehandlingsprogramvare. Dette krever forkunnskaper om anatomien til lungeventilen17. Ved forhøyet arterielt trykk koapt og blokker pulmonalventilens lumen.
- Identifiser skjæreretningen med hensyn til skanneretningen og prøven. Reorientere prøven slik at skjæreretningen er på linje med ønsket akse.
- Identifiser interesseområder for høyoppløselig avbildning. I dette eksperimentet ble magen (midten) av brosjyren og arterio-valvulært kryss valgt.
- Fjern overflødig harpiks og prøve ved enten barberblad eller sliping for store biter av materiale, eller ved mikrotom for finere stykker.
- Når du er på et sted av interesse, sammenlign den fysiske prøven med virtuelle μCT-skiver for å bekrefte plassering. Dette ble gjort ved å sammenligne anatomiske trekk ved tverrsnittet.
6. Seriell blokk ansiktsskanning elektronmikroskopi18
- Reduser tverrsnittet av prøven for å imøtekomme SBF-SEM, ca. 2,0 x 1,5 x 1,8 mm.
- Monter den trimmede prøven på SBF-SEM aluminiumsstubben ved hjelp av epoksy.
- Belegge prøveblokken med 35 nm gull. Snurr prøven på plattformen for å påføre et jevnt lag med belegg.
- Ventil SBF-SEM-kammeret og juster knivbladets høyde til mikroskopets eusentriske høyde.
- Sett inn prøven og utjevne eksempelstubben.
- Bilde under lave vakuumforhold for å forhindre lading og med backscatter-detektor (se tabell S2 for SBF-SEM-anskaffelsesparametere).
- Bilde og sy flere områder av interesse ved ulike forstørrelser ved hjelp av automatisert programvare (se Tabell over materialer).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Anastomose i lungearterien til trykkslangen er vist i figur 1A. Etter påføring av hydrostatisk trykk distends lungestammen radialt (Figur 1B) som indikerer at lungeventilbrosjyrene er i lukket konfigurasjon. Pulmonal ventilkonformasjon ble bekreftet av μCT. I dette tilfellet var brosjyrene coapt (lukket) og annulus var sirkulær (Figur 2A). Figur 2B,C viser varierende grad av utilstrekkelig lungeventiltrykk ved enten fiksering (figur 2B) eller arteriell kollaps ( figur2C).
Prøveblokktrimming ble styrt av μCT-volumgjengivelsen. I dette tilfellet ble flyet parallelt med det sino-rørformede krysset valgt som skjæreretningen. Ved hjelp av anatomiske landemerker ble μCT-volumgjengivelsen av virtuelle tverrsnitt korrelert med optiske bilder (figur 3) for å bekrefte skjæreretningen og plasseringen.
Når prøveblokken var på ønsket sted og orientering, ble høyoppløselige SBF-SEM-bilder tatt i en lokal region i et brosjyre. Bildekorrelasjonen ble gjort mellom det virtuelle μCT-volumgjengivelsesstykket (figur 4A), SBF-SEM-bilder med lav oppløsning (figur 4B) og SBF-SEM-bilder med høy oppløsning (figur 4C). På grunn av den manuelle prøvemonteringen var det nødvendig med nødvendige skiver av prøveblokken for å skape en flat overflate før du anskaffer bilder i SBF-SEM; Derfor er de forskjellige stedene mellom figur 3 og figur 4.
En fullstendig bildekorrelasjon mellom μCT- og SBF-SEM-datasett kan ses i Video 1. Lungeventilprøven i μCT-volumgjengivelsen kan lett ses fra den omkringliggende innebyggingsharpiksen på grunn av farging av tungmetallatomer. Lengder og vinkler måles i bildet for å lede kuttingen. I dette eksemplet ble flyet parallelt med det sino-rørformede krysset brukt. Et virtuelt stykke gjennom emulerer fjerning av materialet til dybden av interesse er nådd. Høyoppløselige bilder tatt av SBF-SEM ble tatt på dette tverrsnittet og registrert på μCT-datasettet.
Når bildene er anskaffet, kan bilder med høy oppløsning tatt av SBF-SEM importeres til en bildeprosessor og kompileres til en 3D-representasjon (figur 5) der ekstracellulære komponenter kan identifiseres.
Figur 1: Representative bilder av anastomosed lungestamme. Den utskilte lungestammen (A) før og (B) etter hydrostatisk trykksetting. Den stiplede linjen indikerer det ventriculo-arterielle krysset der annulus av lungestammen ligger. Legg merke til lungestammen ved trykksetting. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representativ μCT-volumgjengivelse av lungeventil. (A) Lungeventilen er i lukket stilling med brosjyrene tilstrekkelig strukket og koapt (sirkel). (B,C) Utilstrekkelig trykksetting av lungeventilen. Vær oppmerksom på at pakningsvedleggene ikke er ordentlig koapt (B) og at annulus ikke er sirkulær (C). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Bildekorrelasjon av lungeventilprøveblokk. (A) μCT volum gjengivelse virtuell stykke og (B) fysisk prøve blokk etter trimming tatt av optisk mikroskopi. Deler av lungeventilbrosjyrer er sirklet i rødt og ble brukt som landemerker for å korrelere de to forskjellige avbildningsmetodene. Skalalinjen tilsvarer 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Bildekorrelasjon av avbildet lungeventiltrsnitt. (A) Virtuelt tverrsnitt generert av μCT-volumgjengivelse. Rød boks angir området som ble avbildet ved hjelp av SBF-SEM i (B). (B) Oversiktsbilder med lav oppløsning for å korrelere med μCT-tverrsnitt. Blå boks representerer plasseringen av (C) høyoppløselig SBF-SEM-avbildning. Skalastolper tilsvarer (B) 100 μm og (C) 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Segmentert område av lungeventilen tatt av SBF-SEM. Tverrsnittsbilder ble stablet og kompilert for å danne en 3D-representasjon av et lokalt lungeventilområde. Etiketter ble tildelt endotelceller (grønn), valvulære interstitialceller (blå) og ekstracellulære fibre (gul). De omtrentlige dimensjonene til det avbildede området er 30 μm x 20 μm x 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Potensial for rør | 70 kV |
| Rørstrøm | 75 μA |
| Fokuseringsmodus | M |
| Bane | Sirkelrund |
| Projeksjoner/revolusjon | 2880 |
| Modus | 3040 x 3040 piksler |
| Snitt | 1 |
| Eksponeringstid | 1,0 s |
| Avstand fra prøve til pistol | 15 mm |
| Detektor-til-pistol avstand | 725 mm |
| Voxel størrelse | 2,9 μm |
| Synsfelt | 8,4 x 8,4 x 6,3 mm |
Tabell S1: Bildeparametere for μCT.
| Landing energi | 2 - 2,5 kV |
| Bjelkestrøm | 100 -400 pA |
| Arbeidsavstand | 6,5 -7 mm |
| Detektor | VS-DBS |
| Oppholdstid | 1 - 2 μs |
Tabell S2: Imaging-parametere for SBF-SEM.
Video 1: Bildekorrigering av μCT- og SBF-SEM-datasett. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fjerning av ventriklene tjener to formål. For det første, utsette ventrikelen side til atmosfærisk trykk, og dermed bare trenger å bruke et transvalvulært trykk fra arteriell side av lungeventilen for å lukke, og for det andre, gir en stabil base for å forhindre vridning av lungestammen. Under trykksetting distendene lungestammen radialt og dårligere, noe som gjør den utsatt for vridning, noe som forårsaker sammenbruddet av lungestammen. Forhåndslasting av lungeventilen med en saltløsning gir en ekstra kvalitetskontroll for å sikre at trykkavlastningen er tilstrekkelig og hvis det er lekkasjer i systemet. Virkningen av det primære fikseringsmiddelet er raskt, i løpet av noen få sekunder, og uten hydrostatisk forhåndslasting med saltoppløsningen, er lungeventilen festet i en tilfeldig konformasjon. Uten forhåndslasting var suksessraten for en lukket lungeventil rundt 10% -20%. Med forhåndslastingstrinnet var suksessraten over 90%.
μCT- og SBF-SEM-bildeforholdene ble justert for dette programmet. Lungeventilen, når den er helt strukket, kan være mindre enn 10 μm tykk. Som en tommelfingerregel kreves det en terskel på 3 voxels for å kunne løse en funksjon; Så μCT-volumgjengivelsene ble skannet med en voxelstørrelse på 2,9 μm med et synsfelt på 8,4 x 8,4 x 6,3 mm. Mindre voxelstørrelser kan oppnås i μCT, men dette krever enten prøvetrimming og / eller lengre skannetider. En mindre prøve vil tillate høyere oppløsning ved å plassere den nærmere røntgenkilden. Mindre voxels kan også oppnås ved å plassere røntgendetektoren lenger tilbake fra prøven; Dette vil imidlertid redusere den totale fluxen på detektoren og kompromittere signal-til-støy-forholdet. Som referanse var våre μCT-skanninger ca. 5-6 timer i varighet. Spesifikke avbildningsbetingelser som benyttes i denne studien er i supplerende tabell S1 og supplerende tabell S2).
Det er begrensninger for denne metoden. Den kirurgiske delen av denne prosedyren krever ekspertise innen dyrehåndtering for ikke å kompromittere lungeventilstrukturen under håndtering. I tillegg er bildet tidkrevende og krever flere bildeinstrumenter. Som referanse var høyoppløselig SBF-SEM-avbildning omtrent 1 uke med kontinuerlig avbildning for en dybde på rundt 100 μm. Dette er en krevende oppgave for instrumentet å holde seg stabil og konsistent for lange bildebehandlingsøkter. En mer praktisk tilnærming ville være å utarbeide en prøvetakingsstrategi for å nøyaktig skildre heterogeniteten til lungeventilen uten tidsinvesteringen. Dette er ennå ikke bestemt. Til dags dato har hele den korrelative arbeidsflyten blitt gjort på en mus, men har vist gjennomførbarheten og potensialet til den korrelative arbeidsflyten i å undersøke lungeventilen på tvers av lengdeskalaer.
Fremtidige gjentakelser av denne korrelative tilnærmingen kan innebære in situ μCT-eksperimenter, slik at den samme prøven kan utsettes for forskjellig transvalvulært trykk for å fjerne variasjon fra prøve til prøve. Dette er for tiden begrenset av prøve- og instrumentstabilitet for lengre skannetider, et trykkapparat integrert i bildesystemer og kontrast på grunn av lignende dempingskoeffisienter av vann og vev. I tillegg, selv om det transvalvulære trykket reflekterte av fysiologiske forhold, er det ikke representativt for pulsatilestrømmen som er karakteristisk for hjertekontraksjon. Det har imidlertid vist seg at belastningshastigheten har liten effekt på konformasjonen av pakningsvedlegget. I fremtidige gjentakelser kan det vise seg å være mer relevant å konstruere en enhet som er i stand til å administrere pulsatile flow9. I tillegg krever mye av arbeidet manuell avhør av eksemplet, da det for øyeblikket ikke er noen automatisert arbeidsflyt. Lokalisering av lungeventilen, prøvebehandling mot interesseområdet, bildekorrelasjon og registrering ble gjort manuelt, men ville vise seg nyttig i fremtiden for å effektivisere behandlingen og redusere subjektiviteten.
Arbeidet som presenteres er en korrelativ arbeidsflyt for å fikse konformasjonen av lungeventilen og registrere avbildning i μCT og SBF-SEM. Informasjonen oppnådd ved hjelp av denne metoden vil til slutt bli brukt til å bestemme den underliggende biomekanikken til lungeventilen i murindyrmodeller, som ennå ikke er belyst. Valvulær biomekanikk kan beskrives fullstendig av geometrien og den ekstracellulære matrisen, men disse er på to forskjellige lengdeskalaer. For å gjøre dette er det nødvendig med nøyaktig kontroll av ventilens heterogenitet og nøyaktig kartlegging av høyoppløselige bilder av den ekstracellulære matrisen med hensyn til plasseringen i lungeventilen. Denne korrelative arbeidsflyten implementeres allerede i andre eksperimenter for å trekke sammenligninger mellom villtype og transgen osteogenese imperfecta mus for å sammenligne fibrillar ekstracellulære matriseforskjeller og kan lett ekstrapoleres til andre medfødte feil som bikuspidventildannelse19,20. Denne informasjonen kombinert med mulig proteomikk vil gi et komplett bilde av hvordan biomekanikken vil variere mellom de to murindyrmodellene.
Til tross for dette arbeidet som bare skildrer lungeventilen, er denne arbeidsflyten lett å endre til andre heterogene, hierarkiske biologiske systemer. Vi brukte 3D-avbildningsteknikker for å fange den arkitektoniske organiseringen av ECM, men teknikker med høyere oppløsning, for eksempel transmisjonselektronmikroskopi eller skanning av transmisjonselektronmikroskopi, kan legges til avhengig av ønsket informasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet støttes blant annet av R01HL139796 og R01HL128847 tilskudd til CKB og RO1DE028297 og CBET1608058 for DWM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25% glutaraldehyde (aq) | EMS | 16210 | Primary fixative component |
| 0.9% sodium chloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 10 mL syringe | BD | 309604 | |
| 200 proof ethanol | EMS | 15055 | |
| 22G needle | BD | 305156 | |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | |
| 3-way stopcock | Smiths Medical ASD, Inc. | MX5311L | |
| 4% osmium tetroxide | EMS | 19150 | Staining component |
| 4% paraformaldehyde (aq) | EMS | 157-4-100 | Primary fixative component |
| Absorbable hemostat | Ethicon | 1961 | |
| Acetone | EMS | 10012 | |
| Black polyamide monofilament suture, 10-0 | AROSurgical instruments Corporation | TI38402 | |
| Black polyamide monofilament suture, 6-0 | AROSurgical instruments Corporation | SN-1956 | |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratories | 664 | Approximately 1 yo |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| Clamp applying forcep | FST | 00072-14 | |
| Cotton tip applicators | Fisher Scientific | 23-400-118 | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Dumont #5 forcep | FST | 11251-20 | |
| Dumont #5/45 forceps | FST | 11251-35 | |
| Dumont #7 fine forcep | FST | 11274-20 | |
| Durcupan ACM resin | EMS | 14040 | For embedding |
| Fine scissor | FST | 14028-10 | |
| Heliscan microCT | Thermo Fisher Scientific | Micro-CT | |
| Ketamine hydrochloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| L-aspartic acid | Sigma-Aldrich | 56-84-8 | Staining component |
| Lead nitrate | EMS | 17900 | Staining component |
| low-vacuum backscatter detector | Thermo Fisher Scientific | VSDBS | SEM backscatter detector |
| Micro-adson forcep | FST | 11018-12 | |
| Millex-GP filter, 0.22 um, PES 33mm, non-sterile | EMD Millipore | SLGP033NS | |
| Non-woven songes | McKesson Corp. | 94442000 | |
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | Sigma-Aldrich | 14459-95-1 | Staining component |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 | |
| Pressure monitor line | Smiths Medical ASD, Inc. | MX562 | |
| Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride) | Hospira Inc. | NDC 0409-0138-22 | |
| Size 3 BEEM capsule | EMS | 69910-01 | Embedding container |
| Sodium cacodylate trihydrate | Sigma-Aldrich | 6131-99-3 | Buffer |
| Solibri retractors | FST | 17000-04 | |
| Sputter, carbon and e-beam coater | Leica | EM ACE600 | Gold coater |
| Surgical microscope | Leica | M80 | |
| Thiocarbohydrazide (TCH) | EMS | 21900 | Staining component |
| Tish needle holder/forcep | Micrins | MI1540 | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400 | Staining component |
| Volumescope scanning electron microscope | Thermo Fisher Scientific | VOLUMESCOPESEM | Serial Block Face Scanning Electron Microscope |
| Xylazine sterile solution | Akorn Inc. | NADA# 139-236 |
References
- Azari, S., et al. A systematic review of the cost-effectiveness of heart valve replacement with a mechanical versus biological prosthesis in patients with heart valvular disease. Heart Failure Reviews. 25 (3), 495-503 (2020).
- Ng, C. M., et al. TGF-β-dependent pathogenesis of mitral valve prolapse in a mouse model of Marfan syndrome. Journal of Clinical Investigation. 114 (11), 1586-1592 (2004).
- Cheek, J. D., Wirrig, E. E., Alfieri, C. M., James, J. F., Yutzey, K. E. Differential activation of valvulogenic, chondrogenic, and osteogenic pathways in mouse models of myxomatous and calcific aortic valve disease. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 52 (3), 689-700 (2012).
- Jiménez-Altayó, F., et al. Stenosis coexists with compromised α1-adrenergic contractions in the ascending aorta of a mouse model of Williams-Beuren syndrome. Scientific Reports. 10 (1), 889 (2020).
- Thacoor, A. Mitral valve prolapse and Marfan syndrome. Congenital Heart Disease. 12 (4), 430-434 (2017).
- McAnulty, P., Dayan, A., Ganderup, N. -C., Hastings, K., Dawson, H. A Comparative Assessment of the Pig, Mouse and Human Genomes. The Minipig in Biomedical Research. , CRC Press. (2011).
- Hinton, R. B., Yutzey, K. E. Heart valve structure and function in development and disease. Annual Review of Physiology. 73, 29-46 (2011).
- Hinton, R. B., et al. Extracellular matrix remodeling and organization in developing and diseased aortic valves. Circulation Research. 98 (11), 1431-1438 (2006).
- Sacks, M. S., Merryman, W. D., Schmidt, D. E., David Merryman, D. W., Schmidt, D. E. On the biomechanics of heart valve function. Journal of Biomechanics. 42 (12), 1804-1824 (2009).
- Sacks, M. S., Yoganathan, A. P. Heart valve function: a biomechanical perspective. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 362 (1484), 1369-1391 (2007).
- Morales, A. G., et al. Micro-CT scouting for transmission electron microscopy of human tissue specimens. Journal of Microscopy. 263 (1), 113-117 (2016).
- Sacks, M. S., Smith, D. B., Hiester, E. D. The aortic valve microstructure: Effects of transvalvular pressure. Journal of Biomedical Materials Research. 41 (1), 131-141 (1998).
- Ayoub, S., et al. Heart valve biomechanics and underlying mechanobiology. Comprehensive Physiology. 6 (4), 1743-1780 (2016).
- Stella, J. A., Liao, J., Sacks, M. S. Time-dependent biaxial mechanical behavior of the aortic heart valve leaflet. Journal of Biomechanics. 40 (14), 3169-3177 (2007).
- Korn, E. D., Weisman, R. A. I. loss of lipids during preparation of amoebae for electron microscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)/Lipids and Lipid Metabolism. 116 (2), 309-316 (1966).
- Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
- Hinton, R. B., et al. Mouse heart valve structure and function: Echocardiographic and morphometric analyses from the fetus through the aged adult. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 294 (6), 2480-2488 (2008).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. Plos Biology. 2 (11), 1900-1909 (2004).
- Lincoln, J., Florer, J. B., Deutsch, G. H., Wenstrup, R. J., Yutzey, K. E. ColVa1 and ColXIa1 are required for myocardial morphogenesis and heart valve development. Developmental Dynamics. 235 (12), 3295-3305 (2006).
- Hamatani, Y., et al. Pathological investigation of congenital bicuspid aortic valve stenosis, compared with atherosclerotic tricuspid aortic valve stenosis and congenital bicuspid aortic valve regurgitation. PLoS One. 11 (8), (2016).
