Ein skalierbares Modell zur Untersuchung der Auswirkungen von Stumpfkraftverletzungen bei erwachsenen Zebrafischen
Summary
Wir modifizierten das Marmarou-Gewichtsabfallmodell für erwachsene Zebrafische, um eine Breite von Pathologien nach stumpfer traumatischer Hirnverletzung (TBI) und die Mechanismen, die der nachfolgenden neuronalen Regeneration zugrunde liegen, zu untersuchen. Dieses stumpfe TBI-Modell ist skalierbar, induziert ein leichtes, mittelschweres oder schweres SHT und rekapituliert die bei menschlichen TBI beobachtete Verletzungsheterogenität.
Abstract
Stumpfe Schädel-Hirn-Traumata (TBI) sind die häufigste Form des Kopftraumas, das sich über einen dicken Schweregrad erstreckt und zu komplexen und heterogenen Nebenwirkungen führt. Während es keinen Mechanismus gibt, um die verlorenen Neuronen nach einem TBI beim Menschen zu ersetzen oder zu regenerieren, besitzen Zebrafische die Fähigkeit, Neuronen in ihrem ganzen Körper, einschließlich des Gehirns, zu regenerieren. Um die Breite der Pathologien zu untersuchen, die bei Zebrafischen nach einem stumpfen TBI gezeigt werden, und um die Mechanismen zu untersuchen, die der nachfolgenden neuronalen regenerativen Reaktion zugrunde liegen, modifizierten wir den häufig verwendeten Nagetier-Marmarou-Gewichtsabfall für die Verwendung bei erwachsenen Zebrafischen. Unser einfaches Stumpfkraft-TBI-Modell ist skalierbar, induziert einen leichten, mittelschweren oder schweren TBI und rekapituliert viele der Phänotypen, die nach menschlichen TBI beobachtet wurden, wie Kontakt- und posttraumatische Anfälle, Ödeme, subdurale und intrazerebrale Hämatome und kognitive Beeinträchtigungen, die jeweils in Abhängigkeit von der Schwere der Verletzung auftreten. TBI-Folgeerscheinungen, die innerhalb von Minuten nach der Verletzung auftreten, klingen ab und kehren innerhalb von 7 Tagen nach der Verletzung auf nahezu unbeschädigte Kontrollniveaus zurück. Der regenerative Prozess beginnt bereits 48 Stunden nach der Verletzung (hpi), wobei die maximale Zellproliferation von 60 hpi beobachtet wird. So erzeugt unser Zebrafisch-Stumpfkraft-TBI-Modell charakteristische primäre und sekundäre Verletzungs-TBI-Pathologien, die dem menschlichen SHT ähneln, was die Untersuchung des Krankheitsbeginns und -fortschreitens sowie der Mechanismen der neuronalen Regeneration ermöglicht, die für Zebrafische einzigartig sind.
Introduction
Traumatische Hirnverletzungen (TBIs) sind eine globale Gesundheitskrise und eine der Hauptursachen für Tod und Behinderung. In den Vereinigten Staaten erleben etwa 2,9 Millionen Menschen jedes Jahr einen TBI, und zwischen 2006 und 2014 stieg die Mortalität aufgrund von TBI oder TBI-Folgeerkrankungen um über 50%1. TBIs unterscheiden sich jedoch in ihrer Ätiologie, Pathologie und klinischen Präsentation, was zum großen Teil auf den Mechanismus der Verletzung (MOI) zurückzuführen ist, der auch die Behandlungsstrategien und die prognostizierte Prognose beeinflusst2. Obwohl TBIs aus verschiedenen MOI resultieren können, sind sie überwiegend das Ergebnis eines durchdringenden oder stumpfen Gewalttraumas. Penetrierende Traumata machen einen kleinen Prozentsatz der TBIs aus und erzeugen eine schwere und fokale Verletzung, die auf die unmittelbaren und umliegenden aufgespießten Hirnregionen lokalisiert ist3. Im Gegensatz dazu sind stumpfe TBIs häufiger in der Allgemeinbevölkerung, umfassen eine Reihe von Schweregraden (leicht, mittelschwer und schwer) und verursachen eine diffuse, heterogene und globale Verletzung, die mehrere Hirnregionen betrifft1,4,5.
Zebrafische (Danio rerio) wurden verwendet, um eine breite Palette von neurologischen Beleidigungen zu untersuchen, die das zentrale Nervensystem (ZNS) umfassen.6,7,8,9. Zebrafische besitzen im Gegensatz zu Säugetieren auch eine angeborene und robuste regenerative Reaktion, um ZNS-Schäden zu reparieren10. Aktuelle Zebrafisch-Traumamodelle verwenden verschiedene Verletzungsmethoden, einschließlich Penetration, Exzision, chemische Beleidigung oder Druckwellen11,12,13,14,15,16. Jede dieser Methoden verwendet jedoch ein MOI, das von der menschlichen Bevölkerung selten erlebt wird, nicht über eine Reihe von Verletzungsschweregraden skalierbar ist und nicht auf die Heterogenität oder schweregradabhängige TBI-Folge zurückzuführen ist, die nach stumpfer TBI berichtet wurde. Diese Faktoren schränken die Verwendung des Zebrafischmodells ein, um die zugrunde liegenden Mechanismen der Pathologien zu verstehen, die mit der häufigsten Form von SHT in der menschlichen Bevölkerung (leichte stumpfe Gewaltverletzungen) verbunden sind.
Unser Ziel war es, ein schnelles und skalierbares TBI-Zebrafischmodell mit stumpfer Kraft zu entwickeln, das Möglichkeiten zur Untersuchung der Verletzungspathologie, des Fortschreitens von TBI-Folgeerkrankungen und der angeborenen regenerativen Reaktion bietet. Wir modifizierten den häufig verwendeten Nagetier-Marmarou17-Gewichtstropfen und trugen ihn auf erwachsene Zebrafische auf. Dieses Modell ergibt einen reproduzierbaren Schweregradbereich von leicht, mittelschwer bis schwer. Dieses Modell rekapituliert auch mehrere Facetten der menschlichen TBI-Pathologie in einer schweregradabhängigen Weise, einschließlich Anfällen, Ödemen, subduralen und intrazerebralen Hämatomen, neuronalem Zelltod und kognitiven Defiziten wie Lern- und Gedächtnisstörungen. Tage nach der Verletzung lösen sich Pathologien und Defizite auf und kehren zu einem Niveau zurück, das unbeschädigten Kontrollen ähnelt. Darüber hinaus zeigt dieses Zebrafischmodell eine robuste Proliferations- und neuronale Regenerationsreaktion über die Neuroaxis in Bezug auf die Schwere der Verletzung.
Hier geben wir Details zur Einrichtung und Induktion eines stumpfen Gewalttraumas, zur Bewertung posttraumatischer Anfälle, zur Beurteilung von Gefäßverletzungen, Anweisungen zur Vorbereitung von Hirnschnitten, Ansätze zur Quantifizierung von Ödemen und Einblicke in die proliferative Reaktion nach einer Verletzung.
Protocol
Representative Results
Discussion
Untersuchungen zu Neurotrauma und assoziierten Folgeerkrankungen konzentrieren sich seit langem auf traditionelle nicht-regenerative Nagetiermodelle20. Erst kürzlich haben Studien verschiedene Formen von ZNS-Schäden auf regenerative Modelle angewendet9,11,13,14,21. Obwohl aufschlussreich, sind diese Modelle entweder durch die Verwendu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken den Hyde-Labormitgliedern für ihre durchdachten Diskussionen, den Technikern des Freimann Life Sciences Center für die Pflege und Haltung von Zebrafischen und der University of Notre Dame Optical Microscopy Core/NDIIF für den Einsatz von Instrumenten und deren Dienstleistungen. Diese Arbeit wurde vom Center for Zebrafish Research an der University of Notre Dame, dem Center for Stem Cells and Regenerative Medicine an der University of Notre Dame und Zuschüssen des National Eye Institute of NIH R01-EY018417 (DRH), dem National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (JTH), LTC Neil Hyland Fellowship of Notre Dame (JTH) unterstützt. Sentinels of Freedom Fellowship (JTH) und das Pat Tillman Scholarship (JTH).
Materials
| 2-phenoxyethanol | Sigma Alderich | 77699 | |
| #00 buckshot | Remington | RMS23770 | 3.3g weight for sTBI |
| #3 buckshot | Remington | RMS23776 | 1.5g weight for miTBI/moTBI |
| #5 Dumont forceps | WPI | 14098 | |
| 5-ethynyl-2’-deoxyuridine | Life Technologies | A10044 | EdU |
| 5ml glass vial | VWR | 66011-063 | |
| Click-iT EdU Cell Proliferation Kit | Life Technologies | C10340 | |
| CytoOne 12-well plate | USA Scientific | CC7682-7512 | |
| Instant Ocean | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Super frost postiviely charged slides | VWR | 48311-703 | |
| Super PAP Pen Liquid Blocker | Ted Pella | 22309 | |
| Tissue freezing medium | VWR | 15148-031 |
References
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