Un modello scalabile per studiare gli effetti della lesione da forza smussata nel pesce zebra adulto

Summary

Abbiamo modificato il modello di calo di peso di Marmarou per il pesce zebra adulto per esaminare un’ampia gamma di patologie a seguito di lesioni cerebrali traumatiche da forza contundente (TBI) e i meccanismi alla base della successiva rigenerazione neuronale. Questo modello di TBI a forza smussata è scalabile, induce un TBI lieve, moderato o grave e ricapitola l’eterogeneità delle lesioni osservata nel TBI umano.

Abstract

Le lesioni cerebrali traumatiche da forza contundente (TBI) sono la forma più comune di trauma cranico, che copre una gamma di gravità e si traduce in effetti secondari complessi ed eterogenei. Mentre non esiste un meccanismo per sostituire o rigenerare i neuroni persi a seguito di un TBI negli esseri umani, i pesci zebra possiedono la capacità di rigenerare i neuroni in tutto il corpo, incluso il cervello. Per esaminare l’ampiezza delle patologie esibite nel pesce zebra a seguito di un TBI a forza smussata e per studiare i meccanismi alla base della successiva risposta rigenerativa neuronale, abbiamo modificato il calo di peso del roditore Marmarou comunemente usato per l’uso nel pesce zebra adulto. Il nostro semplice modello di TBI a forza smussata è scalabile, inducendo un TBI lieve, moderato o grave e ricapitola molti dei fenotipi osservati dopo TBI umano, come convulsioni da contatto e post-traumatiche, edema, ematomi subdurali e intracerebrali e disturbi cognitivi, ciascuno visualizzato in modo dipendente dalla gravità della lesione. Le sequele tbi, che iniziano a comparire entro pochi minuti dalla lesione, si attenuano e ritornano a livelli di controllo quasi intatti entro 7 giorni dopo l’infortunio. Il processo rigenerativo inizia già 48 ore dopo l’infortunio (hpi), con il picco di proliferazione cellulare osservato da 60 hpi. Pertanto, il nostro modello TBI a forza smussata del pesce zebra produce patologie TBI con lesioni primarie e secondarie caratteristiche simili al TBI umano, che consente di indagare l’insorgenza e la progressione della malattia, insieme ai meccanismi di rigenerazione neuronale che sono unici per il pesce zebra.

Introduction

Le lesioni cerebrali traumatiche (TBI) sono una crisi sanitaria globale e una delle principali cause di morte e disabilità. Negli Stati Uniti, circa 2,9 milioni di persone sperimentano un TBI ogni anno e tra il 2006-2014 la mortalità dovuta a sequele di TBI o TBI è aumentata di oltre il 50%¹. Tuttavia, i TBI variano nella loro eziologia, patologia e presentazione clinica a causa in gran parte del meccanismo di lesione (MOI), che influenza anche le strategie di trattamento e la prognosi ^prevista2. Sebbene i TBI possano derivare da vari MOI, sono prevalentemente il risultato di un trauma penetrante o con forza contundente. I traumi penetranti rappresentano una piccola percentuale di TBI e generano una lesione grave e focale localizzata nelle regioni cerebrali impalate immediate e ^circostanti3. Al contrario, i TBI a forza smussata sono più comuni nella popolazione generale, coprono una gamma di gravità (lieve, moderata e grave) e producono una lesione diffusa, eterogenea e globale che colpisce più regioni del ^{cervello1,4,5}.

I pesci zebra (Danio rerio) sono stati utilizzati per esaminare una vasta gamma di insulti neurologici che attraversano il sistema nervoso centrale (SNC)6,7,8,9. I pesci zebra possiedono anche, a differenza dei mammiferi, una risposta rigenerativa innata e robusta per riparare i danni al ^SNC10. Gli attuali modelli di trauma del pesce zebra utilizzano vari metodi di lesione, tra cui penetrazione, escissione, insulto chimico o onde di ^{pressione11,12,13,14,15,16}. Tuttavia, ciascuno di questi metodi utilizza un MOI che è raramente sperimentato dalla popolazione umana, non è scalabile in una gamma di gravità delle lesioni e non affronta l’eterogeneità o la gravità dipendente dalle sequele TBI riportate dopo TBI a forza contundente. Questi fattori limitano l’uso del modello zebrafish per comprendere i meccanismi alla base delle patologie associate alla forma più comune di TBI nella popolazione umana (lievi lesioni da forza contundente).

Abbiamo mirato a sviluppare un modello di zebrafish TBI a forza smussata rapido e scalabile che fornisca strade per studiare la patologia della lesione, la progressione della sequela tbi e la risposta rigenerativa innata. Abbiamo modificato la caduta di peso del roditore Comunemente usato ^Marmarou17 e l’abbiamo applicata al pesce zebra adulto. Questo modello produce una gamma riproducibile di gravità che vanno da lieve, moderata a grave. Questo modello ricapitola anche molteplici aspetti della patologia TBI umana, in modo dipendente dalla gravità, tra cui convulsioni, edema, ematomi subdurali e intracerebrali, morte delle cellule neuronali e deficit cognitivi, come disturbi dell’apprendimento e della memoria. Giorni dopo l’infortunio, patologie e deficit si dissipano, tornando a livelli simili a controlli non danneggiati. Inoltre, questo modello di zebrafish mostra una robusta proliferazione e una risposta di rigenerazione neuronale attraverso il neuroassico per quanto riguarda la gravità delle lesioni.

Qui, forniamo dettagli sulla configurazione e l’induzione del trauma da forza contundente, il punteggio delle convulsioni post-traumatiche, la valutazione delle lesioni vascolari, le istruzioni sulla preparazione delle sezioni cerebrali, gli approcci per quantificare l’edema e le informazioni sulla risposta proliferativa dopo la lesione.

Protocol

I pesci zebra sono stati allevati e mantenuti nella struttura di Notre Dame Zebrafish nel Freimann Life Sciences Center. I metodi descritti in questo manoscritto sono stati approvati dal Comitato per la cura e l’uso degli animali dell’Università di Notre Dame. 1. Paradigma della lesione cerebrale traumatica Aggiungere 1 mL di 2-fenossietanolo a 1 L di acqua di sistema (60 mg di Instant Ocean in 1 L di acqua RO deionizzata). Preparare un serbatoio di recupero aerato contene…

Representative Results

La preparazione del carro di induzione delle lesioni consente un mezzo rapido e semplicistico per fornire un TBI a forza smussata scalabile al pesce zebra adulto. La gravità graduale del modello di lesione fornisce diverse metriche facilmente identificabili della lesione di successo, sebbene la lesione vascolare sia una delle patologie più semplici e importanti (Figura 3). Il ceppo di pesce utilizzato durante la lesione può rendere questo indicatore più facile o più difficile da identif…

Discussion

Le indagini sui neurotraumi e sulle sequele associate sono state a lungo incentrate sui modelli tradizionali di roditori non rigenerativi20. Solo di recente gli studi hanno applicato varie forme di danno al SNC a modelli rigenerativi9,11,13,14,21. Sebbene approfonditi, questi modelli sono limitati dal loro uso di un metodo di lesione no…

Materials

2-phenoxyethanol	Sigma Alderich	77699
#00 buckshot	Remington	RMS23770	3.3g weight for sTBI
#3 buckshot	Remington	RMS23776	1.5g weight for miTBI/moTBI
#5 Dumont forceps	WPI	14098
5-ethynyl-2’-deoxyuridine	Life Technologies	A10044	EdU
5ml glass vial	VWR	66011-063
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit	Life Technologies	C10340
CytoOne 12-well plate	USA Scientific	CC7682-7512
Instant Ocean	Instant Ocean	SS15-10
Super frost postiviely charged slides	VWR	48311-703
Super PAP Pen Liquid Blocker	Ted Pella	22309
Tissue freezing medium	VWR	15148-031