Un modelo escalable para estudiar los efectos de la lesión por fuerza contundente en peces cebra adultos

Summary

Modificamos el modelo de caída de peso de Marmarou para peces cebra adultos para examinar una amplia gama de patologías después de una lesión cerebral traumática por fuerza contundente (LCT) y los mecanismos subyacentes a la regeneración neuronal posterior. Este modelo de LCT de fuerza contundente es escalable, induce una LCT leve, moderada o grave y recapitula la heterogeneidad de lesiones observada en una LCT humana.

Abstract

Las lesiones cerebrales traumáticas por fuerza contundente (LCT) son la forma más común de traumatismo craneal, que abarca una variedad de gravedades y da como resultado efectos secundarios complejos y heterogéneos. Si bien no existe un mecanismo para reemplazar o regenerar las neuronas perdidas después de una lesión cerebral traumática en humanos, el pez cebra posee la capacidad de regenerar neuronas en todo su cuerpo, incluido el cerebro. Para examinar la amplitud de las patologías exhibidas en el pez cebra después de una LCT de fuerza contundente y estudiar los mecanismos subyacentes a la respuesta regenerativa neuronal posterior, modificamos la caída de peso de Marmarou en roedores de uso común para el uso en peces cebra adultos. Nuestro modelo de LCT de fuerza contundente simple es escalable, induciendo una LCT leve, moderada o grave, y recapitula muchos de los fenotipos observados después de la LCT humana, como convulsiones de contacto y postraumáticas, edema, hematomas subdurales e intracerebrales y deficiencias cognitivas, cada una de las cuales se muestra de una manera dependiente de la gravedad de la lesión. Las secuelas de LCT, que comienzan a aparecer a los pocos minutos de la lesión, desaparecen y vuelven a niveles de control casi intactos dentro de los 7 días posteriores a la lesión. El proceso regenerativo comienza tan pronto como 48 horas después de la lesión (hpi), con el pico de proliferación celular observado por 60 hpi. Por lo tanto, nuestro modelo de LCT de fuerza contundente del pez cebra produce patologías características de LCT de lesión primaria y secundaria similares a la LCT humana, lo que permite investigar el inicio y la progresión de la enfermedad, junto con los mecanismos de regeneración neuronal que son exclusivos del pez cebra.

Introduction

Las lesiones cerebrales traumáticas (LCT) son una crisis de salud mundial y una de las principales causas de muerte y discapacidad. En los Estados Unidos, aproximadamente 2.9 millones de personas experimentan una LCT cada año, y entre 2006-2014 la mortalidad debido a una LCT o secuelas de LCT aumentó en más del 50%¹. Sin embargo, las LCT varían en su etiología, patología y presentación clínica debido en gran parte al mecanismo de lesión (MOI), que también influye en las estrategias de tratamiento y el pronóstico ^previsto2. Aunque las LCT pueden ser el resultado de varios MOI, son predominantemente el resultado de un trauma penetrante o de fuerza contundente. Los traumatismos penetrantes representan un pequeño porcentaje de LCT y generan una lesión grave y focal que se localiza en las regiones cerebrales empaladas inmediatas y ^{circundantes3}. Por el contrario, las LCT de fuerza contundente son más comunes en la población general, abarcan una variedad de gravedades (leve, moderada y grave) y producen una lesión difusa, heterogénea y global que afecta a múltiples regiones cerebrales1,4,5.

El pez cebra (Danio rerio) se ha utilizado para examinar una amplia gama de insultos neurológicos que abarcan el sistema nervioso central (SNC)6,7,8,9. El pez cebra también posee, a diferencia de los mamíferos, una respuesta regenerativa innata y robusta para reparar el daño del ^SNC10. Los modelos actuales de trauma del pez cebra utilizan varios métodos de lesión, incluyendo penetración, escisión, insulto químico u ondas de ^{presión11,12,13,14,15,16}. Sin embargo, cada uno de estos métodos utiliza un MOI que rara vez es experimentado por la población humana, no es escalable en una variedad de gravedades de lesiones y no aborda la heterogeneidad o las secuelas de TBI dependientes de la gravedad reportadas después de una TBI de fuerza contundente. Estos factores limitan el uso del modelo de pez cebra para comprender los mecanismos subyacentes de las patologías asociadas con la forma más común de LCT en la población humana (lesiones leves por fuerza contundente).

Nuestro objetivo fue desarrollar un modelo de pez cebra TBI de fuerza contundente rápido y escalable que proporcione vías para investigar la patología de la lesión, la progresión de las secuelas de TBI y la respuesta regenerativa innata. Modificamos la caída de peso del roedor de uso común ^Marmarou17 y la aplicamos al pez cebra adulto. Este modelo produce un rango reproducible de severidades que van desde leves, moderadas a graves. Este modelo también recapitula múltiples facetas de la patología de TBI humana, de una manera dependiente de la gravedad, incluidas convulsiones, edema, hematomas subdurales e intracerebrales, muerte celular neuronal y déficits cognitivos, como el deterioro del aprendizaje y la memoria. Días después de la lesión, las patologías y los déficits se disipan, volviendo a niveles similares a los controles no dañados. Además, este modelo de pez cebra muestra una respuesta robusta de proliferación y regeneración neuronal a través del neuroeje con respecto a la gravedad de la lesión.

Aquí, proporcionamos detalles sobre la configuración e inducción del trauma por fuerza contundente, la puntuación de las convulsiones postraumáticas, la evaluación de las lesiones vasculares, las instrucciones sobre la preparación de las secciones cerebrales, los enfoques para cuantificar el edema y la comprensión de la respuesta proliferativa después de la lesión.

Protocol

El pez cebra se crió y mantuvo en las instalaciones de Notre Dame Zebrafish en el Centro de Ciencias de la Vida Freimann. Los métodos descritos en este manuscrito fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Notre Dame. 1. Paradigma de la lesión cerebral traumática Agregue 1 ml de 2-fenoxietanol a 1 L de agua del sistema (60 mg de Instant Ocean en 1 L de agua ro desionizada). Prepare un tanque de recuperación aireado que contenga 2 …

Representative Results

La preparación de la plataforma de inducción de lesiones permite un medio rápido y simplista de entregar una LCT escalable de fuerza contundente al pez cebra adulto. La gravedad graduada del modelo de lesión proporciona varias métricas fácilmente identificables de una lesión exitosa, aunque la lesión vascular es una de las patologías más fáciles y prominentes (Figura 3). La cepa de pescado utilizada durante la lesión puede hacer que este indicador sea más fácil o más difícil …

Discussion

Las investigaciones de neurotraumatismos y secuelas asociadas se han centrado durante mucho tiempo en modelos tradicionales de roedores no ^{regenerativos20}. Sólo recientemente los estudios han aplicado diversas formas de daño del SNC a modelos regenerativos9,11,13,14,21. Aunque perspicaces, estos modelos están limitados por el uso de …

Materials

2-phenoxyethanol	Sigma Alderich	77699
#00 buckshot	Remington	RMS23770	3.3g weight for sTBI
#3 buckshot	Remington	RMS23776	1.5g weight for miTBI/moTBI
#5 Dumont forceps	WPI	14098
5-ethynyl-2’-deoxyuridine	Life Technologies	A10044	EdU
5ml glass vial	VWR	66011-063
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit	Life Technologies	C10340
CytoOne 12-well plate	USA Scientific	CC7682-7512
Instant Ocean	Instant Ocean	SS15-10
Super frost postiviely charged slides	VWR	48311-703
Super PAP Pen Liquid Blocker	Ted Pella	22309
Tissue freezing medium	VWR	15148-031