Um modelo escalável para estudar os efeitos da lesão por força bruta em zebrafish adulto

Summary

Modificamos o modelo de queda de peso de Marmarou para o zebrafish adulto para examinar uma amplitude de patologias após lesão cerebral traumática por força bruta (TCE) e os mecanismos subjacentes à regeneração neuronal subsequente. Este modelo de TBI de força bruta é escalável, induz um TCE leve, moderado ou grave, e recapitula a heterogeneidade da lesão observada no TBI humano.

Abstract

Lesões cerebrais traumáticas por força bruta (TCE) são a forma mais comum de traumatismo craniano, que abrange uma série de gravidades e resulta em efeitos secundários complexos e heterogênios. Embora não haja mecanismo para substituir ou regenerar os neurônios perdidos após um TBI em humanos, os zebrafish possuem a capacidade de regenerar neurônios em todo o seu corpo, incluindo o cérebro. Para examinar a amplitude das patologias exibidas em zebrafish após um TBI de força bruta e estudar os mecanismos subjacentes à resposta regenerativa neuronal subsequente, modificamos a queda de peso comumente utilizada de roedor Marmarou para o uso em zebrafish adulto. Nosso modelo de TCE de força bruta simples é escalável, induzindo um TBI leve, moderado ou grave, e recapitula muitos dos fenótipos observados após o TCE humano, como convulsões de contato e pós-traumático, edema, hematomas subdural e intracerebral, e prejuízos cognitivos, cada um exibido de forma dependente de lesões. As sequelas do TCE, que começam a aparecer poucos minutos após a lesão, diminuem e retornam a níveis de controle quase intactos dentro de 7 dias após a lesão. O processo regenerativo começa já em 48 horas após a lesão (hpi), com a proliferação de células máximas observada por 60 hpi. Assim, nosso modelo de TBI de força bruta de zebrafish produz patologias tbi primárias e secundárias características semelhantes às TBI humanas, o que permite investigar o início e a progressão da doença, juntamente com os mecanismos de regeneração neuronal que é exclusivo do zebrafish.

Introduction

Lesões cerebrais traumáticas (TBIs) são uma crise de saúde global e uma das principais causas de morte e incapacidade. Nos Estados Unidos, cerca de 2,9 milhões de pessoas experimentam um TCE a cada ano, e entre 2006-2014 a mortalidade por sequelas de TCE ou TCE aumentou mais de 50% ¹. No entanto, os TBIs variam em sua etiologia, patologia e apresentação clínica devido, em grande parte, ao mecanismo de lesão (MOI), que também influencia as estratégias de tratamento e previu o ^{prognóstico2}. Embora os TBIs possam resultar de vários MOI, eles são predominantemente o resultado de um trauma penetrante ou contundente. Traumas penetrantes representam uma pequena porcentagem de TBIs e geram uma lesão grave e focal localizada nas regiões cerebrais próximas e ^{circundantes3}. Em contraste, as TBIs de força bruta são mais comuns na população geral, abrangem uma série de gravidades (leves, moderadas e graves) e produzem uma lesão difusa, heterogênea e global que afeta múltiplas regiões cerebrais1,4,5.

Os zebrafish (Danio rerio) têm sido utilizados para examinar uma ampla gama de insultos neurológicos que abrangem o sistema nervoso central (CNS)6,7,8,9. Os zebrafish também possuem, ao contrário dos mamíferos, uma resposta regenerativa inata e robusta para reparar danos do ^CNS10. Os modelos atuais de trauma de zebrafish utilizam vários métodos de lesão, incluindo penetração, excisão, insulto químico ou ondas de pressão11,12,13,14,15,16. No entanto, cada um desses métodos utiliza um MOI que raramente é experimentado pela população humana, não é escalável em uma série de gravidades de lesões, e não aborda a heterogeneidade ou sequência de TCE dependente da gravidade relatada após tbi de força bruta. Esses fatores limitam o uso do modelo de zebrafish para compreender os mecanismos subjacentes das patologias associadas à forma mais comum de TCE na população humana (lesões leves por força bruta).

Nosso objetivo foi desenvolver um modelo rápido e escalável de zebrafish TBI de força bruta que fornece caminhos para investigar a patologia da lesão, a progressão das sequelas do TCE e a resposta regenerativa inata. Modificamos a queda de peso do roedor ^Marmarou17 comumente usado e aplicamos-no a zebrafish adulto. Este modelo produz uma gama reprodutível de gravidades que variam de leve, moderada, a grave. Este modelo também recapitula múltiplas facetas da patologia do TCE humano, de forma dependente da gravidade, incluindo convulsões, edema, hematomas subdurais e intracerebrais, morte celular neuronal e déficits cognitivos, como aprendizado e prejuízo de memória. Dias após lesões, patologias e déficits se dissipam, retornando a níveis semelhantes a controles não danificados. Além disso, este modelo de zebrafish exibe uma resposta robusta de proliferação e regeneração neuronal através da neuroaxis em relação à gravidade da lesão.

Aqui, fornecemos detalhes para a configuração e indução de trauma por força bruta, pontuação de convulsões pós-traumáticas, avaliação de lesões vasculares, instruções sobre a preparação de seções cerebrais, abordagens para quantificar edema, e insights sobre a resposta proliferativa após lesão.

Protocol

Os zebrafish foram criados e mantidos na instalação de zebrafish de Notre Dame no Centro de Ciências da Vida de Freimann. Os métodos descritos neste manuscrito foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso de Animais da Universidade de Notre Dame. 1. Paradigma de lesão cerebral traumática Adicione 1 mL de 2-phenoxyetanol a 1 L de água do sistema (60 mg de Oceano Instantâneo em 1 L de água de RO desionizada). Prepare um tanque de recuperação aerado contendo 2 L de…

Representative Results

A preparação da plataforma de indução de lesões permite um meio rápido e simplista de fornecer um TBI escalável de força bruta aos zebrafish adultos. A gravidade classificada do modelo de lesão fornece várias métricas facilmente identificáveis de lesões bem sucedidas, embora a lesão vascular seja uma das patologias mais fáceis e proeminentes (Figura 3). A variedade de peixes utilizada durante a lesão pode tornar este indicador mais fácil ou mais difícil de identificar. Ao u…

Discussion

As investigações de neurotrauma e sequelas associadas têm sido centradas em modelos tradicionais de roedores não ^{regenerativos20}. Somente recentemente, estudos aplicaram várias formas de dano de CNS aos modelos regenerativos9,11,13,14,21. Embora perspicazes, esses modelos são limitados pelo uso de um método de lesão pouco visto …

Materials

2-phenoxyethanol	Sigma Alderich	77699
#00 buckshot	Remington	RMS23770	3.3g weight for sTBI
#3 buckshot	Remington	RMS23776	1.5g weight for miTBI/moTBI
#5 Dumont forceps	WPI	14098
5-ethynyl-2’-deoxyuridine	Life Technologies	A10044	EdU
5ml glass vial	VWR	66011-063
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit	Life Technologies	C10340
CytoOne 12-well plate	USA Scientific	CC7682-7512
Instant Ocean	Instant Ocean	SS15-10
Super frost postiviely charged slides	VWR	48311-703
Super PAP Pen Liquid Blocker	Ted Pella	22309
Tissue freezing medium	VWR	15148-031