Summary
Fluorescensaktiverad cellsortering-radioligandbehandlad vävnad (FACS-RTT) är ett kraftfullt verktyg för att studera rollen av 18 kDa-translokatorproteinet eller Serotonin 5HT2A-receptoruttrycket vid Alzheimers sjukdom i cellulär skala. Detta protokoll beskriver ex-vivo-appliceringen av FACS-RTT i TgF344-AD-råttmodellen.
Abstract
Glialceller har förmodligen en betydande implikation i patofysiologin för neurodegenerativa störningar, såsom Alzheimers sjukdom (AD). Deras förändringar är kanske förknippade med ett proinflammatoriskt tillstånd. TgF344-AD-råttstammen har utformats för att uttrycka humana APP- och humana PS1ΔE9-gener , som kodar för amyloidproteiner Aβ-40 och Aβ-42 och visar amyloidpatologi och kognitiva underskott med åldrande. TgF344-AD-råttmodellen används i denna studie för att utvärdera det cellulära ursprunget för 18 kDa-translokatorproteinet (TSPO, en markör för gliacellaktivering) bindning och 5HT2A-receptorn (5HT2AR) serotoninreceptornivåerna som eventuellt störs i AD. Tekniken som presenteras här är Fluorescensaktiverad cellsortering till radioligandbehandlad vävnad (FACS-RTT), en kvantitativ celltypspecifik teknik som kompletterar in vivo PET eller SPECT eller ex vivo / in vitro autoradiografi tekniker. Den kvantifierar samma radiomärkta spårämne som användes tidigare för avbildning, med hjälp av en γ räknare efter cellsortering av cytometri. Detta gör det möjligt att bestämma det cellulära ursprunget för det radiomärkta proteinet med hög cellulär specificitet och känslighet. Till exempel visade studier med FACS-RTT att (i) ökningen av TSPO-bindning var associerad med mikroglia i en råttmodell av lipopolysackarid (LPS) -inducerad neuroinflammation, (ii) en ökning av TSPO-bindning vid 12- och 18 månader var associerad med astrocyter först och sedan mikroglia hos TgF344-AD-råttor jämfört med vilda typ (WT) råttor, och (iii) striataldensiteten hos 5HT2A R minskar i astrocyter vid 18 månader i samma råtta AD-modell. Intressant nog kan denna teknik utvidgas till praktiskt taget alla radiotracers.
Introduction
Neurodegenerativa sjukdomar, såsom Alzheimers sjukdom (AD), kännetecknas av en neuronal förlust i samband med ökade symtom. AD, den vanligaste orsaken till demens, som står för 60%-70% av fallen, drabbar cirka 50 miljoner människor världen över1. På neuropatologisk nivå är de två huvudsakliga egenskaperna hos AD ackumuleringen av extracellulära amyloid-β (Aβ) plack och intracellulära Tau neurofibrillära trassel. Glialcellsförändringar har också associerats med AD2 och möjlig störning av flera neurotransmittorsystem 3,4.
TgF344-AD-råttlinjen har modifierats till modell AD genom att uttrycka humana APP- och PS1ΔE9-transgener, vilket leder till lösliga och olösliga Aβ-40- och Aβ-42-uttryck och amyloidplackbildning5. Det presenterar också ackumulering av hyperfosforylerade former av Tau-proteinet som leder till tauopati. Från 9-24 månaders ålder utvecklar råttorna gradvis de patologiska kännetecknen för AD och en kognitiv försämring 5,6,7,8,9.
Positronemissionstomografi (PET), Single-Photon Emission computed Tomography (SPECT) och autoradiografi är tekniker baserade på emission och kvantifiering av γ strålar. Radiotracers kvantifieras antingen in vivo (PET och SPECT) eller ex vivo/in vitro (autoradiografi). Dessa känsliga tekniker har bidragit till förståelsen av mekanismer för flera hjärnsjukdomar, såsom AD. När det gäller neuroinflammation finns det faktiskt många studier som bedömer 18 kDa Translocator Protein (TSPO), en in vivo neuroinflammationsmarkör, med radiomärkta spårämnen som [11C] -(R) -PK11195 eller [11C] PBR28 (för granskning se10). Dessutom har förändringar av neurotransmittorsystem studerats med hjälp av radiotracers 11,12,13.
Dessa tekniker bestämmer emellertid inte den radioaktiva signalens cellulära ursprung. Detta skulle kunna hindra tolkningen av den biologiska grunden för ändringen i bindningen av en radioligand i PET/SPECT. Till exempel, när det gäller TSPO-studier av neuroinflammation, är det av största vikt att förstå om ökningen eller minskningen av TSPO beror på astrocytiska eller mikrogliala förändringar. Tekniken Fluorescensaktiverad cellsortering till radioligandbehandlad vävnad (FACS-RTT) utvecklades för att komma runt dessa problem, vilket möjliggjorde bedömning av radioligandbindning i varje celltyp separat och kvantifiering av målproteindensiteten per cell. Denna innovativa teknik är följaktligen kompletterande och mycket kompatibel med PET- och SPECT-avbildning.
Här tillämpades denna teknik längs två axlar: studien av neuroinflammation med användning av TSPO-specifika radioligander och bedömning av det serotonerga systemet. På den första axeln var målet att förstå TSPO-signalens cellulära ursprung som svar på en akut inflammatorisk reaktion. Därför användes FACS-RTT på hjärnvävnaderna hos råttor efter induktion av neuroinflammation via en lipopolysackaridinjektion (LPS) och efter en in vivo [125I] CLINDE SPECT-avbildningsstudie. Vidare tillämpades samma avbildnings- och FACS-RTT-protokoll på 12- och 24 månader gamla TgF344-AD-råttor och matchande vildtypsråttor (WT). Den andra axeln syftade till att bestämma ursprunget till serotoninerga systemförändringar i denna råttmodell via ex vivo 5-HT2AR densitetsbedömning efter celltyp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella förfaranden genomfördes i samförstånd med etikkommittén för mänskliga och djurförsök i kantonen Genève, den kantonala kommissionen för forskningsetik (CCER) respektive den allmänna riktningen för hälsan i kantonen Genève (Schweiz). Data rapporteras enligt riktlinjer för djurförsök: Rapportering av in vivo-experiment (ARRIVE).
1. SPECT-kameraförberedelse och kalibrering
- Slå på kameran, ladda operativsystemet (se materialtabell). Klicka på Home XYZ Stage-knappen för att utföra homing.
- Konfigurera experimentet som består av en 10 minuters genomsökningsinsamling. Ställ in stegläget på Fine och Acquisition-läget på Listmode (för att spela in hela emissionsspektrumet).
- Ställ in sängen och se till att uppvärmningssystemet, andningssensorn och anestesin är funktionella och säkra (figur 1A-D). Placera sedan ett fantom (dvs. 2 ml av en känd koncentration på 125I i ett 2 ml mikrofugerör) där djurets huvud kommer att placeras (centrerat på området, figur 1E).
- Ställ in skanningsområdet genom att skjuta markörerna för de tre dimensionerna med hjälp av de tre bilderna längst ner på skärmen. Se till att fantomets och djurets skanningsvolym är densamma.
- Starta den fiktiva genomsökningen för efterföljande kalibrering med de parametrar som fastställs i steg 1.2–1.4.
2. Arbetsyteinställning för SPECT-avbildning
- Rengör arbetsytan med desinfektionsglasudycid och placera mjuka papper på alla ytor.
- Se till att det finns tillräckligt med isofluran och syre i deras respektive tankar.
- Förbered en 24 G kateter genom att skära av fenorna på fjärilskatetern för att få en tydligare bild av råttans svansven.
- Täck katetern genom att fylla den helt med heparinlösning (25000 U/ml) efter att nålen har tagits bort. Placera sedan nålen tillbaka i den för att undvika blodproppsbildning efter kateterinsättning.
3. [125I] CLINDE radiotracer syntes
VARNING: Radioaktivitet kan ha tillräcklig joniserande energi för att påverka atomerna i de levande cellerna och skada deras genetiska material (DNA).
- Se till att arbeta i en lämplig miljö, godkänd för experiment med radioaktivitet.
OBS: Använd lämplig personlig skyddsutrustning (PPE) för radioaktivitetshantering, inklusive finger- och kroppsdosimetrar. Försök att hålla dig på ett säkert avstånd från alla källor till radioaktivitet. - Inkubera 100 μg tributylinprekursor i 100 μL ättiksyra med natriumjodid (Na125I) (se materialtabell) och 5 μl 37 % perättiksyra vid 70 °C i 20 minuter i en termocykling placerad i en handskfack.
- Späd reaktionen med 50% acetonitril (ACN) i vatten för att nå en volym av 500 μL. Injicera 500 μL av den utspädda reaktionen på en omvänd faskolonn (se materialtabell).
- Isolera [125I]CLINDE med en linjär gradient HPLC-körning från 5% -95% ACN i 7 mM H3PO4 i 10 minuter. Späd isolatet iH2Oför att uppnå en slutlig volym på 10 ml och injicera sedan den utspädda reaktionen på en koncentrationskolonn (se materialtabell).
- Eluera [125I] CLINDE från kolonnen med 300 μL absolut etanol och indunsta sedan etanolen genom att inkubera den i en vakuumcentrifug vid RT i 40 minuter.
- Späd återstoden som innehåller [125I]CLINDE i 300 μl steril saltlösning för att skapa en stamlösning.
- Efter mätning av dess radioaktivitet, späd stamlösningen i steril saltlösning för att erhålla en lösning av 0,037 MBq i 500 μL.
- Rena spårämnet med HPLC (Högpresterande vätskekromatografi). Bestäm elueringstiden med hjälp av en standardkalibrering vid 450 nm och isolera den enda radioaktiva toppen. Utför standardkalibreringskurvan med sju standardkoncentrationer av kall (icke-radioaktiv) CLINDE (0,1 μg, 0,5 μg, 0,75 μg, 1 μg, 1,5 μg, 2 μg och 5 μg i 400 μL av en lösning av 50% ACN). Fastställa den radiokemiska renheten genom att mäta en enda topp i radio-TLC (Tunnskiktskromatografi). Se till att renheten hos den radiokemiska är över 60%.
- Kontrollera den specifika aktiviteten hos radioliganden som mäter ultraviolett absorbans vid 450 nm och de kalibreringskurvor som fastställts med kalla referensföreningar. Se till att den specifika aktiviteten är större än 1000 GBq/μmol.
4. [125 I]R91150 radiotracer syntes
Se till att följa samma säkerhetsregler som nämns i avsnittet CLINDE-syntes.
- Blanda 300 μg R91150-prekursor i en lösning av 3 μL absolut etanol, 3 μL isättika, 15 μL bärarfri Na125I (se materialtabell) (10 mCi) i 0,05 M NaOH och 3 μL 30%H2O2. Inkubera i 30 min i en handskfack.
- Injicera hela reaktionen i en omvänd faskolonn (se materialtabell).
- Isolera [125I]R91150 med isokratisk HPLC-körning (ACN/vatten 50/50, 10 mM ättiksyrabuffert) med en flödeshastighet på 3 ml/min.
- Späd [125I]R91150 iH2Oför en slutlig volym på 10 ml.
- Injicera 10 ml av den utspädda reaktionen på en koncentrationskolonn (se materialtabell).
- Elue [125I]R91150 från kolonnen med 300 μL absolut etanol.
- Indunsta etanolen genom att inkubera den i en vakuumcentrifug vid RT i 40 min.
- Späd återstoden innehållande [125I]R91150 i 300 μl saltlösning.
- Rena spårämnet med HPLC. Bestäm elueringstiden med en standardkalibrering vid 450 nm och isolera den enda radioaktiva toppen. Fastställ den radiokemiska renheten genom att mäta en enda topp i radio-TLC. Se till att renheten hos den radiokemiska är över 98%.
5. Förberedelse av djur
- Väg och bedöva TgF344-AD-råttan (hane eller hona, från 2-24 månader) i en induktionskammare med 3% isofluran. När du är djupt sövd sänker du isofluranflödet till 2% (0,4 l / min, 100% O2) i kammaren.
- Placera djuret på en förvärmd säng utrustad med en anestesi nosecone. Behåll isofluran vid 2 % (0,4 l/min, 100 %O2).
- Applicera ögongel smörjmedel i djurets ögon och bekräfta djupet av anestesi via andningsövervakning; justera anestesi vid behov.
- Utför 24 G kateterinsättning i svansvenen.
6. SPECT-förvärv
- Överför djuret till kamerabädden utrustad med en temperaturkontrollerad värmedyna inställd på 38 °C (bild 1E).
- Säkra djurets huvud på bettstången och fixa huvudstöden.
- Ställ in experimentet på en 60 minuters skanning som utgör 60 bilder på 1 min. Återanvänd alla andra parametrar som ställdes in i steg 1. Klicka på knappen Uppdatera bild för att uppdatera djurpositionen.
- Ställ in skanningsområdet genom att skjuta markörerna med hjälp av de tre bilderna längst ner på skärmen för de tre dimensionerna.
- Injicera 500 μL av den radioaktiva radiotracern ([125I]CLINDE eller [125I]R91150) och spola sedan röret med 300 μL steril 0,9% NaCl. Klicka samtidigt på Starta förvärv för att starta skanningen.
- Under skanningstiden, se till att hålla djuret under konstant anestesi med andningshastighetsövervakning. Justera flödet av isofluran vid behov.
- När skanningen är över, avliva snabbt det sövda djuret genom halshuggning.
7. Skanna rekonstruktion
- Öppna programvaran för skanningsrekonstruktion (se Materialförteckning) och öppna sedan datauppsättningen och leta efter filen [filnamn].parametrar, skapad i mappen för skanningen.
- Välj isotopen av intresse. Observera att parametern Listmode tillåter flera isotopval i det här steget.
- Välj följande parametrar: 0,4 mm Voxel-storlek, 4 (POS-EM) delmängder, 6 iterationer (motsvarande 24ME-EM), inget efterfilter och isotopen motsvarande sönderfallskorrigering. Välj utdataformat till NIfTI och välj sedan Starta SPECT-rekonstruktion .
8. Råtta hjärnan utvinning
- I samma anestesihändelse som skanningsproceduren och efter att ha säkerställt djurets djupa anestesitillstånd genom att övervaka dess andningsfrekvens, fortsätt till halshuggningen med guillotin och överför snabbt huvudet till dissektionsbänken.
- Skär försiktigt huden ovanpå huvudet med en sax från baksidan till framsidan till mitten av ögonen.
- Skär av överflödiga muskler runt basen av skallen och livmoderhalsen.
- Placera sedan försiktigt ett saxblad i hålet på baksidan av skallen, foramen magnum, och ta bort den bakre delen av skallen med kirurgisk tång.
- Sedan, med kirurgisk tång, ta försiktigt bort den övre delen av skallen. Skallen på gamla hanråttor kan vara tjock, ta bort som små bitar för att undvika skador på hjärnan.
- Skär försiktigt hjärnhinnorna med sax. Meninges kan skada hjärnan under extraktionsprocessen; ta bort det som en försiktighetsåtgärd.
- När du har tagit bort den övre delen av skallen, vrid djurets huvud runt och dra försiktigt ut hjärnan med en liten platt spatel genom att skära de optiska och trigeminala nerverna.
- Överför försiktigt hjärnan till en plan, ren glasyta för dissektion på is.
- Använd en platt metallspatel och ett rakblad för att dissekera hjärnans intressanta regioner. Placera vävnaderna i ett 2 ml centrifugrör och väg den erhållna vävnaden. Använd hjärnsektionen direkt för cellisolering eller frys den snabbt i flytande kväve för senare användning.
9. Cellisolering
- Se till att arbeta i en ren och steril miljö. Att arbeta under ett klass-II biosäkerhetsskåp (BSC) rekommenderas. Se till att handskarna och all utrustning som införs i BSC är sterila.
- För att förbereda cellerna för cellsortering, följ protokollet från Jaclyn M. Schwarz14.
OBS: I detta experiment användes ett kommersiellt tillgängligt neuralt dissociationskit (se materialtabell) för cellberedning.- Lägg proverna i ett 2 ml centrifugrör med 1 ml HBSS (Ca- och Mg-fritt) och centrifugera sedan (300 x g, 2 min, rumstemperatur = RT) och ta bort supernatanten utan att störa pelleten.
- Tillsätt 1900 μL enzymblandning-1 och inkubera den i 15 minuter vid 37 °C medan du omrör rören genom invertering var 5:e minut.
- Tillsätt 30 μL enzymblandning-2, agitera försiktigt med pipett 1 (se materialtabell) fram och tillbaka 30 gånger. Inkubera sedan i 15 minuter vid 37 °C medan du omrör rören genom inversion var 5:e minut.
- Blanda försiktigt fram och tillbaka med pipett 2 och pipettera sedan 3 innan du ruvar i 10 minuter vid 37 °C för att dissociera vävnaderna.
- Filtrera cellerna med en 80 μm cellsil, tillsätt 10 ml HBSS (Ca- och Mg-fri). Centrifugera (300 x g, 10 min, RT) och ta bort supernatanten utan att störa pelleten.
- För uttömning av myelin, återsuspendera pelleten med 400 μL buffert för borttagning av myelin (se materialtabell) och tillsätt sedan 100 μL myelinborttagningspärlor (se materialtabell) innan du inkuberar i 15 minuter vid 4 °C.
- Tillsätt 5 ml myelinavlägsnande buffert, centrifugera (300 x g, 10 min, RT) och ta bort supernatanten utan att störa pelleten.
- Tillsätt 500 μL myelinavlägsnande buffert och placera röret i magnetfältkolonnen. Tvätta kolonnen med 1 ml myelinavlägsnande buffert fyra gånger.
- Centrifugera (300 x g, 2 min, RT) och ta bort supernatanten utan att störa pelleten. Vortex kort (2 s) för att dissociera cellerna och tillsätt 5 μL Fc-block CD32. Virvla igen och inkubera i 5 min vid 4 °C.
- Tillsätt 100 μL av blandningen av primära antikroppar av intresse; inkubera i 20 min vid 4 °C.
- Centrifugera (350 x g, 5 min, 4 °C) och avlägsna supernatanten utan att störa pelleten. Tappa rören upp och ner på mjukt papper.
- Efter en kort virvel (2 s), tillsätt 100 μl av den sekundära antikroppsblandningen och inkubera i 15 minuter vid 4 °C.
- Tillsätt 2 ml myelinavlägsnande buffert, centrifugera (350 x g, 5 min, 4 °C) och ta bort supernatanten utan att störa pelleten. Tappa rören upp och ner på mjukt papper. Resuspendera cellerna i 250 μL steril PBS och fortsätt direkt till cellsortering.
10. Cell sortering
- Förbered mikrofugeröret med 500 μL steril PBS för att samla de sorterade cellerna.
- Tillsätt 10 μL Hoechst per 1000 μL celllösning för att färga kärnorna i de levande cellerna och skilja dem från de döda cellerna.
- Överför cellerna så snart som möjligt till cellsorteringsmaskinen vid 4 °C.
- Sortera först cellerna efter framåt- och sidospridning och sortera sedan de positiva Hoechst-cellerna. Sortera sedan cellerna baserat på antikroppar av intresse. Samla de positivt färgade cellerna separat. Se till att skilja de positiva cellerna från de autofluorescerande.
- Räkna antalet sorterade celler för varje pool av intresse.
11. Gammaräkning
- Kalibrera γ räkningssystemet med 10 μl av samma fantomlösning som användes för SPECT-kalibreringen men späd det i 1 ml vatten.
OBS: Fantomlösningen späds ut på grund av den förbättrade precisionen hos γ räkningssystemet. - Placera röret med sorterade celler i γ räkningssystem och fortsätt med γ räkning enligt tillverkarens protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
WT-råttor upplevde in vivo SPECT-skanning med [125I]CLINDE radiotracer efter en ensidig LPS-injektion (figur 2). Denna skanning (med hjälp av summerade data från bilder av 45-60 min post radiotracerinjektion) visade högre bindning av [125I] CLINDE på platsen för LPS-injektionen (figur 2A) än i hjärnans kontralaterala region (figur 2B). Ex vivo-proverna som genomgick FACS-RTT bekräftade dessa resultat och avslöjade närvaron av ett högre antal [125I] CLINDE-bindningsställen endast i mikroglia, vilket visar att det cellulära ursprunget för [125I] CLINDE-signalen i den ipsilaterala sidan av hjärnan var mikroglial (figur 3A)15.
Med hjälp av samma [125I] CLINDE radiotracer utfördes protokollet sedan på hippocampus av gamla TgF344-AD-råttor (12- och 24 månader gamla) och jämfördes med 24 månader gamla WT. Resultaten visade att ökningen av TSPO-bindning vid 12 månader hos TgF344-AD-råttor var begränsad till astrocyter. Hos 24 månader gamla råttor berodde ökningen av TSPO-bindning på både astrocytiska och mikrogliala förändringar (figur 3B). Resultaten visade att TSPO-överuttrycket i astrocyter troligen observeras före den mikrogliala. Oberoende, med hjälp av radiotracer [125I] R91150, användes denna teknik i cellulär skala för att visa att hos äldre TgF344-AD-råttor visade striatala astrocyter en minskad 5HT2AR densitet jämfört med WT (Figur 3C)16.
Slutligen utfördes FACS-RTT på humana AD post mortem-prover. Efter dissociation inkuberades cellerna med [125I] CLINDE före färgning och FACS-proceduren. Detta gjorde det möjligt att upptäcka ett kortikalt överuttryck av TSPO i både astrocyter och mikroglia hos AD-försökspersoner jämfört med åldersmatchade kontroller (figur 3D).
Bild 1: SPECT-kamerainställning. (A) SPECT-kamerans övergripande presentation. (B) Sängpresentation med värmare och andningsfrekvensövervakning. (C) Pluggar för anestesirör. (D) Uppvärmningsbädd och andningssonduttag. (E) Övervakningsvy för fantompositionering från programvaran. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: TSPO-hjärnavbildning med SPECT med [125I] CLINDE radiotracer. Representativa bilder (45-60 min efter injektion av [125I]CLINDE) av hippocampus efter (A) LPS eller (B) saltlösningsinjektion i den ipsilaterala (vita) och kontralaterala (röda) sidan av hjärnan. In vivo tidsaktivitetskurvor uppmätta i intressevolymen representeras i den högra panelen. SPECT: datortomografi med en fotonemission; TSPO: translokatorprotein; LPS: lipopolysackarid. n = 7 djur per tillstånd. Denna siffra har modifierats från Tournier et al.15. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Kvantifiering av TSPO och 5HT2AR. (A) Cellulärt ursprung för TSPO-överuttryck efter en ensidig hjärninjektion av LPS. Radioaktiviteten mättes (% injicerad dos/g vävnad) i varje cellpopulation i den kontralaterala (grå, n = 7) och den ipsilaterala (gröna, n = 7) sidan av injektionen. Statistiskt test som används: parat t-test. (B) TSPO hos gammal TgF344-AD råtta. [125I]CLINDE-koncentrationerna (% injicerad dos/g vävnad) bestämdes hos 24 månader gamla vilda djur (grå, n = 9) och hos 12- (grön, n = 8) och 24 månader gammal (lila, n = 7) TgF344- AD-råttor. Statistiskt test som används: tvåvägs ANOVA. (C) 5HT2AR minskar i astrocyter i striatum hos gamla TgF344-AD-råttor. Koncentrationen [125I] R91150 bestämdes i astrocyter och mikroglia på cellnivå (% injicerad dos / cell) i WT (grå, n = 7) och gamla TgF344-AD (grön, n = 11) råttor. Statistiskt test som används: enkelriktad ANOVA. (D) Cell proveniens av TSPO-överuttryck i frontal cortex vid Alzheimers sjukdom (AD). I varje cellpopulation mäts radioaktiviteten (% injicerad dos/g vävnad) hos AD-försökspersoner (grön, n = 9) och kontroll (grå, n = 9). Statistiskt test som används: oparade t-test. Alla data representeras som medelvärde ± 95% CI med följande anteckning: * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Såvitt vi vet var denna teknik den första som beskrev ett tillvägagångssätt som möjliggör en bättre förståelse av in vivo-bindande förändringar av en radiotracer på cellulär nivå. Protokollet beskriver en flerskalig metod för att kvantifiera radiotracerbindning på cellulär nivå med [125I] CLINDE (TSPO) eller [125I] R91150 (5HT2AR) som exempel.
Denna teknik är robust och känslig nog för att exakt detektera det cellulära ursprunget för ett brett spektrum av glialcellsförändringar som sträcker sig från en intensiv inflammatorisk reaktion inducerad av LPS till mer subtila glialcellförändringar observerade i en råttmodell av AD, vilket ger viktig kompletterande information till in vivo-kärnneuroimaging , som det mikrogliala ursprunget för signalen erhållen med SPECT som bestämdes. Studien visade vidare att FACS-RTT till och med kunde urskilja neuroreceptordensitetsförändringar på cellulär skala med exemplet 5HT2AR (figur 3C). Slutligen tillhandahölls bevis för att använda tekniken i humana postmortemvävnader, vilket visade en ökad TSPO-koncentration i astrocyter och mikroglia hos AD-patienter.
Den största fördelen med denna teknik är dess komplementaritet med PET- och SPECT-avbildning. Faktum är att kärnavbildning är en kraftfull teknik som kan extrahera information från en hjärnregion eller voxelnivå. Emellertid ligger dess gräns på cellulär skala; det är omöjligt att skilja varje celltyps bidrag till signalen. FACS-RTT gör det möjligt att gå längre genom att avslöja en radiotracerkoncentration i varje celltyp. Intressant nog kan i teorin en obegränsad uppsättning mål bedömas med denna teknik, begränsningen är tillgången på en radiotracer för målet av intresse.
De kritiska stegen i protokollet inkluderar användning av radioaktivitet som måste utföras i en säker miljö med kvalificerad personal. Dessutom är det viktigt att överväga radioaktivt sönderfall. För FACS-beredning måste man säkerställa antikroppsspecificitet, våglängd, ljusintensitet som skiljer sig beroende på celltyp och behöver optimeras för effektiv cellsortering.
En av begränsningarna med denna teknik som understryks i de studier som presenteras här ligger i att använda åldrade djur och mänskliga hjärnprover efter döden på grund av autofluorescerande celler. Lipofuscin, dvs en rest av lysosomal matsmältning, är fluorescerande och ackumuleras i åldrande neuroner, mikroglia och astrocyter. FACS kan, med tidigare optimering, skilja autofluorescerande celler från positivt märkta, vilket är ett viktigt steg om äldre djur studeras. En annan begränsning med tekniken är omöjligheten att direkt jämföra radiotracerkoncentrationen mellan de olika sorterade celltyperna mellan olika djur. Detta kunde utföras om koncentrationen av de icke-metaboliserade, icke-proteinbundna radiotracersna i blod övervägdes för normalisering mellan djur.
En sista begränsning är behovet av att all utrustning som används, t.ex. cyklotron, PET / SPECT-kamera, FACS och γ-räknare, ska vara i nära fysisk närhet till varandra, särskilt om isotoper med kort halveringstid används för in vivo-avbildning och FACS-RTT.
FACS-RTT skulle också kunna användas som ett fristående tillvägagångssätt, dvs. inte nödvändigtvis efter en in vivo-kärnavbildningsstudie 15. Komplexiteten hos hjärnsjukdom kräver att man studerar mekanismer på cellnivå eller encellsskala. FACS-RTT kan vara ett translationellt verktyg som överbryggar in vivo-avbildningsmetoder med ett brett spektrum av ex vivo- eller in vitro-cellulära och molekylärbiologiska metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Swiss National Science Foundation (bidrag nr 320030-184713). Författarna BBT och KC stöds av Velux Foundation (projekt n. 1123). Författare ST fick stöd från Swiss National Science Foundation (Early Post-Doc Mobility Scholarship, nr. P2GEP3_191446), Prof. Dr. Max Cloetta Foundation (Clinical Medicine Plus-stipendiet) och Jean och Madeleine Vachoux Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | ||
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | ||
| BioVet | BioVet | Software for vitals check | |
| Bondclone C18 reverse-phase column | Phenomenex, Schlieren, Switzerland | ||
| Des-Sur | University Hospital of Geneva | Virucide | |
| Fc Block / anti-CD32 | BD Biosciences | BDB550270 | Reactivity for rat |
| FITC-conjugated anti-rat CD90 | Biolegend | 202504 | Reactivity for rat |
| Heparin | B. Braun | B01AB01 | |
| HPLC | Knauer | ||
| Insyte-W 24 GA 0.75 IN 0.7 x 19 mm | BD Biosciences | 321312 | 24 G catheter |
| Isoflurane | Baxter | ZDG9623 | |
| Lacryvisc | Alcon | 2160699 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Micropore soft tape | 3M | F51DA01 | |
| MILabs-Uspect II | MILabs | Software for SPECT Camera | |
| MoFlo Astrios | Beckman Coulter | Cell sorter | |
| Myelin Removal Beads II | Miltenyi Biotec | 130-096-733 | Contains beads and myelin removal buffer. |
| NaCl 0.9% Sterile solution | B. Braun | 395202 | |
| Neural Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | Contains the enzyme mixes, pipets 1, 2 and 3. |
| Nylon Mesh Sheet | Amazon | CMN-0074-10YD | 40 inch width, 80 micron size mesh |
| Peracetic acid | Sigma-Aldrich | ||
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| R91150 précursor | CERMN | ||
| Sep-Pak C18 Column | Waters | Concentration column | |
| Sodium iodide Na125 | PerkinElmer | ||
| Tributylin precursor | CERMN | ||
| U-SPECT Rec2.38c | MILabs | Version Rec2.38c | Software for SPECT images reconstruction |
| USPECT II | MILabs | Spect Camera | |
| Wizard 3" | PerkinElmer | Gamma counter |
References
- Nichols, E., et al. regional, and national burden of Alzheimer's disease and other dementias, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet Neurology. 18 (1), 88-106 (2019).
- Kinney, J. W., et al. Inflammation as a central mechanism in Alzheimer's disease. Alzheimer's & Dementia. 4, New York, N. Y. 575-590 (2018).
- D'Amelio, M., Puglisi-Allegra, S., Mercuri, N. The role of dopaminergic midbrain in Alzheimer's disease: Translating basic science into clinical practice. Pharmacological Research. 130, 414-419 (2018).
- D'Amelio, M., Serra, L., Bozzali, M. Ventral tegmental area in prodromal Alzheimer's disease: Bridging the gap between mice and humans. Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 63 (1), 181-183 (2018).
- Cohen, R. M., et al. A transgenic Alzheimer rat with plaques, tau pathology, behavioral impairment, oligomeric aβ, and frank neuronal loss. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (15), 6245-6256 (2013).
- Morrone, C. D., et al. Regional differences in Alzheimer's disease pathology confound behavioural rescue after amyloid-β attenuation. Brain: A Journal of Neurology. 143 (1), 359-373 (2020).
- Berkowitz, L. E., Harvey, R. E., Drake, E., Thompson, S. M., Clark, B. J. Progressive impairment of directional and spatially precise trajectories by TgF344-Alzheimer's disease rats in the Morris Water Task. Scientific Reports. 8 (1), 16153 (2018).
- Koulousakis, P., vanden Hove, D., Visser-Vandewalle, V., Sesia, T. Cognitive improvements after intermittent deep brain stimulation of the nucleus basalis of meynert in a transgenic rat model for Alzheimer's disease: A preliminary approach. Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 73 (2), 461-466 (2020).
- Tournier, B. B., et al. Spatial reference learning deficits in absence of dysfunctional working memory in the TgF344-AD rat model of Alzheimer's disease. Genes, Brain, and Behavior. , 12712 (2020).
- Tournier, B. B., Tsartsalis, S., Ceyzériat, K., Garibotto, V., Millet, P. In vivo TSPO signal and neuroinflammation in Alzheimer's disease. Cells. 9 (9), (2020).
- Backes, H. [11C]raclopride and extrastriatal binding to D2/3 receptors. NeuroImage. 207, 116346 (2020).
- Millet, P., et al. Quantification of dopamine D(2/3) receptors in rat brain using factor analysis corrected [18F]Fallypride images. NeuroImage. 62 (3), 1455-1468 (2012).
- Tsartsalis, S., et al. A modified simplified reference tissue model for the quantification of dopamine D2/3 receptors with [18F]Fallypride images. Molecular Imaging. 13 (8), (2014).
- Schwarz, J. M. Using fluorescence-activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52537 (2015).
- Tournier, B. B., et al. Fluorescence-activated cell sorting to reveal the cell origin of radioligand binding. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 40 (6), 1242-1255 (2020).
- Tournier, B. B., et al. Astrocytic TSPO upregulation appears before microglial TSPO in Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 77 (3), 1043-1056 (2020).
