Respirometria de alta resolução para avaliar bioenergésicos em células e tecidos usando respirômetros baseados em câmara e placas

Summary

Avaliar a fosforilação oxidativa usando respirômetros de alta resolução tornou-se parte integrante da análise funcional das mitocôndrias e do metabolismo de energia celular. Aqui, apresentamos protocolos para a análise do metabolismo de energia celular usando respirômetros de alta resolução baseados em câmara e microplatos e discutimos os principais benefícios de cada dispositivo.

Abstract

A respirometria de alta resolução (HRR) permite monitorar a fosforilação oxidativa em tempo real para análise de estados de energia celular individuais e avaliação de complexos respiratórios usando protocolos diversificados de titulação inibidora de substrato-uncoupler (SUIT). Aqui, demonstra-se o uso de dois dispositivos de respirometria de alta resolução, e uma coleção básica de protocolos aplicáveis para a análise de células cultivadas, fibras musculares esqueléticas e cardíacas, e tecidos moles como o cérebro e o fígado são apresentados. Protocolos para células e tecidos cultivados são fornecidos para um respirômetro baseado em câmara e células cultivadas para um respirômetro à base de microplato, ambos abrangendo protocolos de respiração padrão. Para fins comparativos, as células HEK293 projetadas pelo CRISPR deficientes na tradução mitocondrial que causam deficiência múltipla do sistema respiratório são usadas com ambos os dispositivos para demonstrar defeitos celulares na respiração. Ambos os respirômetros permitem uma medição abrangente da respiração celular com seus respectivos méritos técnicos e adequação dependente da questão da pesquisa e do modelo em estudo.

Introduction

Mitocôndrias cumprem a oferta-chave de energia e são uma organela compartimentalizada contribuindo para processos bioenergetics celulares essenciais e metabólicos, como anabolismo de nucleotídeos, lipídios e aminoácidos, biogênese do aglomerado de enxofre de ferro e estão implicados em sinalização como morte celular controlada ^1,2,3 . A bioenergeticia mitocondrial através da fosforilação oxidativa contribui para quase todos os processos celulares dentro da célula e, consequentemente, disfunções mitocondriais de origem primária ou secundária estão associadas a um amplo espectro de condições da doença ^4,5. A disfunção mitocondrial envolve não apenas alterações na estrutura ou densidade mitocondrial, mas também na qualidade e regulação do sistema respiratório⁶. Este elemento qualitativo abrange controle de substrato, características de acoplamento, modificações pós-translacionais, dinâmica cristae e supercomplexos respiratórios ^7,8. Portanto, a análise precisa da bioenergetics mitocondrial para abordagens experimentais e diagnósticas para avaliar o metabolismo energético da célula é importante na saúde e na doença.

Fosforilação oxidativa mitocondrial (OXPHOS) é uma sequência de reações dentro do sistema respiratório ou sistema de transferência de elétrons (ETS) para a geração de energia celular através de triptosfato de adenosina (ATP)⁹. O passo multienzimático para aproveitar a energia do fluxo de elétrons através dos complexos I e II ao complexo IV gera um gradiente eletroquímico de prótons através da membrana mitocondrial interna, posteriormente utilizado para fosforilação de difosfato de adenosina (ADP) para ATP via complexo V (F₁F_O ATP synthase) (Figura 1A).

Primeiro, os portadores de dois elétrons são gerados durante o ciclo tricarboxílico (TCA), glicolise e oxidação piruvato: dinucleotídeo de adenina de nicotinamida (NADH) e dinucleotídeo de adenina dihidroflavina (FADH₂). O NADH é oxidado no complexo I (NADH desidrogenase), durante o qual dois elétrons são transferidos para a coenzima Q (quinona é reduzida a quinol), enquanto prótons são bombeados para o espaço intermembrano (IMS). Em segundo lugar, o complexo II (Succinato desidrogenase) oxida FADH₂ e alimenta os elétrons para coenzima Q sem bombear prótons. Em terceiro lugar, no complexo III (Cytochrome c oxidoreductase), elétrons da coenzima Q são transferidos para citocromo c enquanto prótons são bombeados para o IMS. Em quarto lugar, o citocromo c transfere os elétrons para o complexo IV (Cytochrome c oxidase), o complexo final para bombear prótons, e onde o oxigênio funciona como um aceitador de elétrons para assimilar prótons, formando água. É esse oxigênio que as mitocôndrias consomem que pode ser medido por um oxígrafo. Finalmente, os prótons gerados a partir do complexo I, complexo III e complexo IV são usados para rodar o complexo V, gerando ASSIM ATP⁹.

É importante ressaltar que a transferência de elétrons ocorre não apenas de forma linear, de outra forma denotada como a cadeia de transporte de elétrons. Em vez disso, os elétrons podem ser transferidos para a piscina coenzima Q através de múltiplas vias respiratórias e facilitar o fluxo de elétrons convergentes. Os substratos e succinatos do NADH, por exemplo, podem entrar por meio do complexo I e do complexo II, respectivamente. Elétrons da oxidação de ácidos graxos podem ser doados através do complexo de flavoproteína de transferência de elétrons. De fato, uma análise abrangente do OXPHOS requer uma abordagem holística com substratos de combustível apropriados (Figura 1A).

Figura 1: Fosforilação oxidativa mitocondrial e protocolos específicos de substrato e inibidor. (A) Mitoconddrion e esquema do sistema de transferência de elétrons (CI-CIV) e mitocondrial F₁F₀ ATP synthase (CV). Todas as estruturas são do PDB. As figuras retratam apenas substratos e inibidores descritos neste estudo). (B) Traços de amostra de fluxo de oxigênio em células HEK293 intactas usando protocolo padrão em um dispositivo mHRR. (C) Traços amostrais de fluxo de oxigênio em células HEK293 intactas usando protocolo padrão em um dispositivo cHRR. (D) Traços amostrais de fluxo de oxigênio em fibroblastos humanos permeabilizados de um doador saudável com o respectivo protocolo SUIT. Abreviaturas: 1 = Respiração rotineira de células intactas; 2 = Estado 2; 3 = Estado 3(I); 4 = Estado 3(I) com cítara; 5 = Estado 3 (I+II); 6 = Vazamento(OM); 7 = Capacidade de ETS; 8 = S(ROT); 9 = ROX; 10 = TMPD; 11 = Az. ROT = Rotenone, AM = Antimicina, ATP = Adenosina triphosfato, Az = Azide, OM = Oligomicina, FCCP = Cianeto carbonilizado p-trifluoro-metoxifenil-hidratante; Asc = Ascorbate, TMPD = N,N,N′,N’-tetramethyl-p-fenilelenediamina, Succ = Succinato, M = Malato, P = Piruado, ADP = Difosfato de Adenosina, NAD = Nicotinamida adenina dinucleotídeo, IMS = Espaço Intermembrano, FAD = Flavin adenina dinucleotídeo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A análise da capacidade mitocondrial oxphos usando HRR tornou-se um método bioquímico instrumental de valor diagnóstico não apenas para defeitos mitocondriais primários^10,11, mas estendendo-se a todos os outros domínios da biologia, como câncer e envelhecimento¹². O HRR permite a determinação da respiração celular pela análise da capacidade mitocondrial de OXPHOS, que reflete diretamente deficiência do complexo respiratório mitocondrial individual ou combinado, e indiretamente está associada à disfunção celular e ao metabolismo energético alterado⁹. Metodologicamente, as medidas respiratórias são realizadas utilizando células, tecidos ou mitocôndrias isoladas ^11,13,14, com material congelado apenas parcialmente adequado^15,16. O tecido congelado é mostrado ter um ETS intacto com estabilidade de supercomplex mantido¹⁵. Assim, ao contrário dos intermediários tradicionais do TCA, os respectivos substratos são diretamente alimentados no ETS. No entanto, o acoplamento entre a síntese de ETS e ATP é perdido à medida que a integridade da membrana é comprometida por danos congelantes (formação de cristais de gelo).

Experimentos de respiração normalmente ocorrem a uma temperatura fisiológica de 37 °C para endotermias em células ou tecidos não permeabilizados ou permeabilizados. Enquanto o primeiro considera o contexto metabólico citosomático, este último fornece a contribuição energética dos complexos oxphos individuais e do ATPase através da adição de substratos específicos (e inibidores). A sequência e variação de substratos e inibidores levaram ao desenvolvimento de uma matriz diversificada de protocolos SUIT¹⁷ e ensaios¹⁸ para abordar várias questões científicas da função OXPHOS (revisadas abaixo de¹²). O protocolo básico de respiração celular avalia quatro estados diferentes: i) respiração de rotina – a respiração em uma respectiva mídia respiratória sem qualquer adição de substratos ou inibidores que consumam, mas substratos endógenos. Este estado pode revelar defeitos de respiração geralmente ou induzidos por secundários causados, por exemplo, por perfis metabólitos alterados. Em seguida, a adição do oligomicina inibidora de ATPase revela a permeabilidade da membrana mitocondrial interna aos prótons, definida como ii) respiração de vazamento. A titulação subsequente de um prótonophore como o desacontedor cianeto de cyanide carbonyl p-trifluoro-metoxiphenyl-hydrazone (FCCP) permite determinar o estado em que a capacidade de ETS é máxima em um modo de circuito de próton aberto transmembrano, definido como iii) respiração nãocopada. É importante ressaltar que um estado desacoplado também pode ocorrer por intervenções experimentais através de danos mecânicos excessivos às membranas mitocondriais. Por outro lado, o estado não acoplado refere-se ao desacoplamento respiratório por um mecanismo intrínseco que é fisiologicamente controlado. Finalmente, a inibição completa do ETS por adição do complexo inibidor III antimicina e do inibidor complexo I rotenona determina o consumo residual de oxigênio (ROX) de processos não mitocondriais de consumo de oxigênio (Figura 1A-C).

A bioenergetics mitocondrial consiste em cinco estados de respiração distintos^19,20. A respiração do estado 1 é sem substratos adicionais ou ADP, exceto pelo que está disponível de forma endógena. Após a adição de ADP, mas ainda assim, sem substratos, a respiração estadual 2 é alcançada. Quando substratos são adicionados, permitindo transferência de elétrons e síntese ATP, a respiração do estado 3 é atingida. Neste estado, a capacidade oxphos pode ser definida em concentrações saturadas de ADP, fosfato inorgânico, oxigênio, nadh- e substratos ligados ao succinato. A respiração do estado 4 ou a respiração DE VAZAMENTO podem ser definidas como um estado sem ADP ou sintetizadores ATP quimicamente inibidos enquanto têm substratos suficientes. Por fim, quando todo o oxigênio é esgotado (anoxico) em um ambiente de câmara fechada, o estado 5 respiração é observado.

Existem vários métodos para avaliar os estados de energia celular¹⁴ com dois dispositivos dominando a avaliação atual em tempo real do OXPHOS através da análise do consumo de oxigênio, medido como função da diminuição do oxigênio ao longo do tempo em um sistema de câmara fechada com diferentes aplicabilidade dependentes do modelo experimental e da questão da pesquisa: o respirômetro oroboros de alta resolução e o analisador de fluxo extracelular Seahorse XF. Ambos os dispositivos registram as taxas de consumo de oxigênio como uma diminuição nos picomoles (pmol) de oxigênio (O₂) por segundo como um valor absoluto dentro da câmara ou poço de microplato. O consumo específico de oxigênio por massa é obtido pela normalização do respectivo consumo de oxigênio em uma receita tampão específica por número de células (milhões), peso tecidual (mg) ou quantidade de proteína.

O O2k (Instrumentos Oroboros) é um sistema fechado de duas câmaras equipado com um sensor de oxigênio polarográfico (abreviado como respirômetro de alta resolução baseado em câmara: cHRR). Cada câmara experimental contém 2 mL de líquido que é mantido homogêneo por agitadores magnéticos. O sensor de oxigênio polarográfico utiliza uma abordagem amperométrica para medir o oxigênio: contém um cátodo de ouro, um ânodo de cloreto de prata/prata, e entre uma solução KCI criando uma célula eletroquímica sobre a qual uma tensão (0,8 V) é aplicada. O oxigênio do ensaio difere através de uma membrana fluorina de etileno fluorado de 25 μm (O 2-permeável) e sofre redução no cátodo, produzindo peróxido de hidrogênio. No ânodo, a prata é oxidada por peróxido de hidrogênio, gerando uma corrente elétrica. Esta corrente elétrica (ampere) está linearmente relacionada com a pressão parcial de oxigênio. A pressão parcial do oxigênio e o fator de solubilidade de oxigênio do meio de ensaio são usados para calcular a concentração de oxigênio. Uma vez que a pressão parcial do oxigênio depende da temperatura experimental e as medidas polarográficas são sensíveis à temperatura, as flutuações na temperatura precisam de regulação precisa (±0,002 °C) por um bloco de aquecimento Peltier. A temperatura pode ser controlada dentro de uma faixa de 4 °C e 47 °C.

O analisador de fluxo extracelular Seahorse XF (Agilent) é um sistema baseado em placas com formato de microplaca de 24 ou 96 poços no qual três eletrodos de fluorescência medem o consumo de oxigênio ao longo do tempo em cada poço (abreviado como respirômetro de alta resolução baseado em microplaca: mHRR). Um máximo de quatro portas no cartucho de ensaio estão disponíveis para injeção automatizada durante o ensaio. Um ensaio contém vários ciclos, cada um com três fases: 1) mistura, 2) espera e 3) medição. Durante a fase de medição, as sondas de sensores são reduzidas na microplacão criando uma câmara temporariamente fechada contendo volume de 7-10 μL para medir a luz emitida. Esta luz é emitida por fluoroforos embutidos em polímero na ponta das sondas do sensor, que sentem O₂ com base na saciamento da fosforescência. A intensidade do sinal de fluorescência é proporcional a O₂ e influenciada pela temperatura do sensor e do meio de ensaio. Portanto, a estimativa precisa de oxigênio requer uma abordagem relativa com um poço de fundo sem qualquer amostra. A restauração da concentração de oxigênio ocorre durante a fase de mistura quando o sensor se move para cima e para baixo para misturar o volume acima da câmara temporária. Cada ciclo calcula uma taxa de consumo de oxigênio. A temperatura pode ser controlada dentro de uma faixa de 16 °C e 42 °C.

O HRR é o padrão-ouro para avaliar bioenergetics celulares em doenças primárias e mitocôndrias associadas e metabolismo celular geral. Neste estudo, protocolos básicos para HRR são fornecidos para avaliar a função OXPHOS em células e tecidos.

Figura 2: Fluxo de trabalho para preparações celulares e tecidos para rCR, e preparação celular para respirometria mHRR. (A) Esboço dos protocolos fornecidos. (B) Células mamíferas (passo 1.2): pelota HEK293 igual a 3 x 10⁶ células (painel esquerdo). Tecido não fibroso (passo 1.3): Preparação de cerebelo murino em 2 mL Teflon potter (painel médio). Permeabilização do músculo esquelético induzida por sapona (etapa 1.4) painel direito) para respirometria de HRR. (C) Layout de semeamento de microplaca padrão (etapa 2.4) e verificação de confluência para a análise de células eucarióticas (HEK293) para respirometria mHRR. (D, E) Esquema de carregamento da porta de injeção para respirometria mHRR (etapa 2.4). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocol

Toda a experimentação animal é realizada de acordo com o National Animal Experiment Review Board e a Agência Regional De Administração Estadual para o Sul da Finlândia. Foram utilizados neste estudo camundongos C57BL/6JOlaHsd masculinos (4-6 meses de idade). O consentimento para o uso de linhas celulares humanas foi obtido do comitê de ética institucional da Universidade de Helsinque. 1. Respirometria de alta resolução: respirômetro baseado em câmara (cHRR) <p c…

Representative Results

Aqui, fornecemos protocolos para determinar os bioenergetics mitocondriais em células eucarióticas, tecido não fibroso (por exemplo, cerebelo) e tecido fibroso (por exemplo, músculo esquelético). Para células eucarióticas, hek293 com nocaute projetado por CRISPR de duas proteínas diferentes associadas à tradução mitocondrial resultando em múltiplas (CRISPRKO1) e deficiência oxphos grave/completa (CRISPRKO2) foram medidas com cHRR (Figura 3A-C</stron…

Discussion

Tradicionalmente, bioenergetics mitocondriais tem sido estudado com eletrodos de oxigênio do tipo Clark. A falta de resolução e throughput, no entanto, justificava o avanço tecnológico. Até o momento, o O2k (conhecido como cHRR) e o Seahorse XF96 Flux Analyzer (conhecido como mHRR) foram amplamente adotados no campo dos bioenergésicos celulares. Aqui, apresentamos uma coleção compreensível de protocolos para análise do metabolismo de energia celular através da avaliação da respiração mitocondrial usando c…

Materials

2 mL Potter-Elvehjem Glass/PTFE Tissue Grinder/Homogenizer	Omni International	07-358029
95% O2, 5% CO2 medical gas mixture			Potter for tissue grinding
ADP	Sigma	A 4386
Antimycin A	Sigma	A 8674	Chemical
Ascorbate	Merck	PHR1279-1G	Chemical, dissolve in ethanol
BSA (fatty accid free)	Sigma	A 6003	Chemical
CaCO3	Sigma	C 4830	Chemical
Cytochrome c	Sigma	C 7752	Chemical
Digitonin	Sigma	D 5628	Chemical
Dithiothreitol	Sigma	D 0632	Chemical, dissolve in DMSO
D-Sucrose	Roth	4621.1	Chemical
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (High glucose)	Fisher Scientific	41965-039	Chemical
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (No Glucose)	Fisher Scientific	A14430-01
EGTA	Sigma	E 4378
Etomoxir	Sigma	E1905	Chemical
Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	AM12500	Chemical
Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	AM12501
FCCP	Sigma	C 2920
Glucose	Sigma	G7021	Chemical, dissolve in ethanol
Glutamate	Sigma	G 1626	Chemical
GlutaMax (100x) (200 nM L-alanyl-L-glutamine dipeptide)	Fisher Scientific	35050061	Chemical
HEK293 cells	ATTC	CRL-1573
Hemocytometer	Fisher Scientific	0267151B	Instrument for cell counting
Hepes	Sigma	H 7523	Chemical
Imidazole	Fluka	56750	Chemical
KCl	Merck	1.04936	Chemical
L-carnitine	Sigma	C0283	Chemical
Malate	Sigma	M 1000	Chemical
MES hydrate	Sigma	M8250	Chemical
MgCl2	Sigma	M 9272	Chemical
Na2ATP	Sigma	A 2383	Chemical
Na2Phosphocreatine	Sigma	P 7936	Chemical
Na-pyruvate (100 mM) (100x)	Fisher Scientific	11360070
NEAA (Non-essential amino acids) 100x	Fisher Scientific	11140035
Normal FBS (10x)	Fisher Scientific	10500064
O2k-Core: Oxygraph-2k	Oroboros Instruments	10000-02	High-resolution respirometry instrument
O2k-Titration Set	Oroboros Instruments	20820-03	Hamilton syringes for chemical injections
Oligomycin	Sigma	O 4876	Chemical, dissolve in ethanol
Palmitoylcarnitine	Sigma	P 4509	Chemical
Penicillin-Streptomycin	Fisher Scientific	15140122
Pierce BCA Protein Assay Kit	Fisher Scientific	23227
Pyruvate	Sigma	P 2256	Chemical
RIPA-Buffer	Fisher Scientific	89900	Chemical
Rotenone	Sigma	R 8875	Chemical, dissolve in ethanol
Saponin	Sigma	S7900	Chemical
Seahorse XF DMEM assay medium pack, pH 7.4	Agilent, Santa Clara, CA	103680-100
Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer	Agilent, Santa Clara, CA		High-throughput respirometry instrument
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent, Santa Clara, CA		Includes assay plates, cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and calibrant solution.
Small scissors	Fisher Scientific	08-951-20
Sodium azide	Sigma	S2002	Chemical
Succinate	Sigma	S 2378	Chemical
Taurine	Sigma	T 8691	Chemical
TMPD	Sigma	T 3134	Chemical
Trypan Blue solution	Merck	72-57-1	Chemical
Trypsin 0.25% EDTA	Fisher Scientific	25200056
Two thin-edged forceps	Fisher Scientific	12-000-122
Uridine stock (500x)	Sigma	U3750	Chemical