Summary
Hier presenteren we een protocol voor het screenen van bodembiodiversiteit om te zoeken naar schimmelstammen die betrokken zijn bij de afbraak van recalcitrante materialen. Ten eerste worden schimmelstammen die kunnen groeien op humuszuren of lignocellulose geïsoleerd. Hun activiteit wordt vervolgens getest, zowel in enzymatische assays als op verontreinigende stoffen zoals koolwaterstoffen en kunststoffen.
Abstract
Milieuvervuiling is een toenemend probleem en het identificeren van schimmels die betrokken zijn bij het bioremediatieproces is een essentiële taak. De bodem herbergt een ongelooflijke diversiteit aan microbieel leven en kan een goede bron zijn van deze bioremediatieve schimmels. Dit werk heeft tot doel bodemschimmels met bioremediatiepotentieel te zoeken door gebruik te maken van verschillende screeningstests. Minerale cultuurmedia aangevuld met recalcitrante stoffen als enige koolstofbron werden gebruikt als groeitests. Eerst werden bodemverdunningen op petrischalen verguld met mineraal medium gewijzigd met humuszuren of lignocellulose. De groeiende schimmelkolonies werden geïsoleerd en getest op verschillende substraten, zoals complexe mengsels van koolwaterstoffen (vaseline en gebruikte motorolie) en poeders van verschillende plastic polymeren (PET, PP, PS, PUR, PVC). Kwalitatieve enzymatische tests werden geassocieerd met de groeitests om de productie van esterasen, laccases, peroxidasen en proteasen te onderzoeken. Deze enzymen zijn betrokken bij de belangrijkste afbraakprocessen van recalcitrant materiaal en hun constitutieve secretie door de onderzochte schimmelstammen zou het potentieel kunnen hebben om te worden benut voor bioremediatie. Meer dan 100 stammen werden geïsoleerd en getest, en verschillende isolaten met een goed bioremediatiepotentieel werden gevonden. Kortom, de beschreven screeningstests zijn een eenvoudige en goedkope methode om schimmelstammen met bioremediatiepotentieel uit de bodem te identificeren. Bovendien is het mogelijk om de screeningstests voor verschillende verontreinigende stoffen aan te passen aan de vereisten, door andere recalcitrante stoffen toe te voegen aan minimale kweekmedia.
Introduction
De bodem is een fundamenteel onderdeel van het leven op aarde en is de basis van vele ecosystemen. De mineralen, organische stof en micro-organismen in de bodem kunnen als één systeem worden beschouwd, met nauwe associaties en interacties tussen hen. De interacties van deze verbindingen hebben een belangrijke invloed op terrestrische processen, milieukwaliteit en de gezondheid van ecosystemen1. Bodemverontreiniging levert wereldwijd ernstige milieuproblemen op. De willekeurige, langdurige en overmatige toepassing van recalcitrante en giftige stoffen, zoals pesticiden, aardolieproducten, kunststoffen en andere chemicaliën, heeft ernstige gevolgen voor de bodemecologie en kan als gevolg daarvan de bodemmicrobiota veranderen. Microbiële gemeenschappen in de bodem bestaan uit een breed scala aan organismen in verschillende fysiologische toestanden, waarvan de meerderheid bacteriën en schimmels zijn. Veel van de verontreinigingen in de bodem hebben stabiliteit op middellange tot lange termijn en hun persistentie kan leiden tot de ontwikkeling van adaptieve mechanismen waarmee de micro-organismen recalcitrante stoffen als voedingsstoffen kunnen gebruiken 2,3. Deze micro-organismen kunnen daarom in aanmerking komen voor bioremediatietechnieken.
Bioremediatie probeert de effecten van vervuiling te verminderen door micro-organismen en hun enzymen te gebruiken voor de afbraak of omzetting van afval in minder toxische of niet-toxische verbindingen. Verschillende soorten archaea, bacteriën, algen en schimmels bezitten dit bioremediatievermogen4. Als gevolg van hun specifieke biologisch afbreekbare acties zijn schimmels vooral veelbelovende organismen voor bioremediatie. Ze kunnen verschillende substraten aanvallen met behulp van hun hyphal-netwerk, waardoor ze efficiënter de bodemmatrix kunnen binnendringen dan andere micro-organismen. Bovendien kunnen ze ontoegankelijke interstices bereiken waar verontreinigingen moeilijk te verwijderen zijn5, en ze kunnen ook lage vochtniveausoverleven 6. Bovendien synthetiseren schimmels verschillende cassettes van niet-specifieke enzymen, meestal om natuurlijke recalcitrante stoffen zoals cellulose, lignine en humuszuren af te breken. Degenen die het doelsubstraat missen, kunnen betrokken zijn bij de afbraak van een breed scala aan recalcitrante verontreinigende stoffen, zoals koolwaterstoffen, kunststoffen en pesticiden 7,8,9,10. Daarom, hoewel veel schimmelsoorten al zijn gemeld als bioremediatiemiddelen, is er een toenemende interesse in het verkennen van soorten die nog niet zijn bestudeerd om kandidaten te selecteren voor de bioremediatie van recalcitrante verontreinigende stoffen. De soorten waarvan al bekend is dat ze bioremediatie-eigenschappen hebben, behoren tot de phyla Ascomycota 11,12,13, Basidiomycota14,15 en Mucoromycota. Van de geslachten Penicillium en Aspergillus is bijvoorbeeld bekend dat ze betrokken zijn bij de afbraak van alifatische koolwaterstoffen13, verschillende plastic polymeren 16,17,18, zware metalen 19 en kleurstoffen20. Evenzo hebben studies uitgevoerd op basidiomycetenschimmels, zoals Phanerochaete chrysosporium en Trametes versicolor, hun betrokkenheid bij de oxidatie van recalcitrante materialen zoals aromatische koolwaterstoffen13 en kunststoffen21 aangetoond. Een ander voorbeeld van schimmels die betrokken zijn bij de biologische afbraakprocessen zijn de zygomyceten Rhizopus spp., Mucor spp. en Cunninghamella spp.22,23. In het bijzonder is Cunninghamella in staat om aromatische koolwaterstoffen te oxideren en wordt het beschouwd als een modelorganisme voor het bestuderen van de ontgifting van producten uit een breed scala aan xenobiotica13.
Er zijn verschillende schimmelenzymen betrokken bij de belangrijkste afbraakprocessen van recalcitrante materialen 24,25, zoals esterase, laccase, peroxidase en protease. Laccases zijn koperhoudende oxidaties die in de cel worden geproduceerd en vervolgens worden uitgescheiden, die de oxidatie van een verscheidenheid aan fenolische en aromatische verbindingen mogelijk maken. Ze kunnen ortho- en paradifenolen, de aminogroepbevattende fenolen, lignine en de arylgroepbevattende diaminesafbreken 26. Peroxidasen gebruiken waterstofperoxide als mediator om lignine en andere aromatische verbindingen af te breken. Er zijn veel verschillende peroxidasen, maar degenen met het grootste potentieel om giftige stoffen af te breken zijn lignineperoxidase en mangaanperoxidase27.
Esterasen en proteasen behoren tot de groep van extra- of ectocellulaire enzymen, die buiten hun cellen van oorsprong werken, maar er nog steeds aan gebonden zijn. Deze enzymen kunnen de hydrolyse van grote recalcitrante moleculen katalyseren tot kleinere. Vanwege hun lage substraatspecificiteit kunnen deze enzymen een sleutelrol spelen bij de bioremediatie van verschillende verontreinigende stoffen, zoals textielkleurstoffen, effluenten die vrijkomen uit de pulp- en papierindustrie en leerlooien, aardolieproducten, kunststoffen en pesticiden 28,29,30.
Een aantal screeningsmethoden om te selecteren op bioremediatieve schimmelstammen zijn al gepubliceerd. Agarmedium op basis van stro is bijvoorbeeld gebruikt om te screenen op witrotschimmels met een hoog potentieel in de afbraak van polycyclische aromatische koolwaterstoffen (PAK's)31; en kleine stukjes rottend hout zijn op moutextract agar (MEA) geplaatst om houtrotschimmels te isoleren32. De meeste methoden die al zijn voorgesteld, selecteren echter zeer specifieke schimmels op hun activiteit van belang. Dit onderzoek stelt een bredere aanpak voor voor het selecteren van bodemschimmels met een breder scala aan acties. De methode is gebaseerd op de initiële plating van seriële verdunningen van bodemmonsters op een medium dat is gewijzigd met humuszuren of lignocellulose gemengd met antibiotica om schimmels te selecteren met het vermogen om deze natuurlijke recalcitrante stoffen af te breken. Humuszuren en lignocellulose zijn in feite stoffen die extreem resistent zijn tegen biologische afbraak, omdat ze zeer complexe moleculaire structuren hebben, en dit stelt hen in staat om uitstekende indicatoren te zijn van het afbreekbare vermogen van de geteste schimmels33,34. Vervolgens worden de schimmels die in de eerste tests zijn geselecteerd, gescreend om die te identificeren met het potentieel om specifieke verontreinigende stoffen zoals vaseline, gebruikte motorolie en kunststoffen af te breken. Ten slotte worden kwalitatieve enzymatische tests uitgevoerd om schimmelstammen te detecteren die enzymen kunnen produceren die betrokken zijn bij de biologische afbraakprocessen van recalcitrante stoffen. Voor dit doel worden protease- en esterasetests uitgevoerd, terwijl galluszuur en guaiacol worden gebruikt als indicatoren voor laccase- en andere ligninolytische enzymproductie35,36. Deze substraten worden gebruikt omdat er een sterke correlatie is gevonden tussen het vermogen van schimmels om ze te oxideren tot hun bruingekleurde vorm en het bezit van ligninolytisch vermogen 37,38,39.
Door deze protocollen is het mogelijk om schimmelstammen met een hoog degraderend potentieel en een breed werkingsspectrum rechtstreeks uit bodemmonsters te isoleren. De isolatie van deze schimmelstammen kan helpen bij het vinden van nieuwe kandidaten voor bioremediatiedoeleinden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Selectie van schimmelstammen die recalcitrante materialen uit de bodem kunnen afbreken
- Bereiding van antibiotische oplossing.
- Doe penicilline (50 mg / L), streptomycine (40 mg / L), chloortetracycline (40 mg / L), neomycine (100 mg / L) en chlooramfenicol (100 mg / L) in 250 ml gedeïoniseerd steriel water.
- Voordat u chlooramfenicol aan de antibiotische oplossing toevoegt, lost u het op in 3 ml ≥99% ethanol.
- Plaats de antibioticumoplossing gedurende 10 minuten op een magneetroerder (geen warmte) met een magnetische roerstaaf in de oplossing. Bewaren bij 4 °C.
- Voorbereiding van groeimedia.
- Doe 1 g commercieel humuszuur, 3,26 g Bushnell-Haas bouillon (BH) en 15 g agar in 1 L gedeïoniseerd water en autoclaaf het gedurende 20 minuten bij 121 °C (humuszuur agar).
- Leg de humuszuuragar in petrischalen onder een laminaire stroomkast.
- Doe 4 g lignocellulose, 3,26 g BH en 15 g agar in 1 l gedeïoniseerd water en autoclaaf het gedurende 20 minuten bij 121 °C (lignocellulose agar).
- Plaats de lignocellulose-agar in petrischalen onder een laminaire stroomkast.
- Breng onder een laminaire stroomkast, nadat de media in de petrischalen zijn gestold, 1 ml van de antibioticumoplossing over op de voorbereide platen met behulp van een steriele spuit met een filter van 0,2 μm om het te steriliseren.
- Verdeel de antibioticumoplossing gelijkmatig over de plaatoppervlakken met behulp van een steriele L-vormige wegwerpcelstrooier en laat deze aan de lucht drogen onder de laminaire stroomkast.
- Doe 20 g moutextractbouillon en 15 g agar in 1 L gedeïoniseerd water en autoclaaf het gedurende 20 minuten bij 121 °C (moutextract agar - MEA).
- Leg de MEA in petrischaaltjes onder een laminaire stromingskast.
- Bodembemonstering en bodemverdunningen.
- Bemonster de grond van belang op een diepte van 10 cm, verwijder alle planten, gras en dode bladeren van de bovenste laag en doe het in steriele polyethyleen zakken.
- Na het bereiken van het laboratorium, zeef de grond met behulp van een 2 mm gaas, verwijder eventuele wortels en plantenresten.
- Als het niet mogelijk is om de stroomafwaartse analyse meteen uit te voeren, bewaar de gezeefde bodemmonsters dan bij 4 °C.
- Werk onder een laminaire stromingskast en doe 1 g van de gezeefde grond in een steriele buis van 15 ml met 10 ml steriel gedeïoniseerd water (1 x 10-1 verdunning). Schud de buis horizontaal gedurende 30 minuten.
- Neem onder een laminaire stromingskast, voordat de suspensie bezinkt, 1 ml van de 1 x 10-1 verdunning met een steriele pipet en breng deze over in een 9 ml gedeïoniseerd water blanco (1 x 10-2 verdunning). Vortex het grondig.
- Voordat de suspensie bezinkt, neemt u 1 ml van de 1 x 10-2 verdunning met een steriele pipet en brengt u deze over in een blanco water van 9 ml gedeïoniseerd water (1 x 10-3 verdunning). Vortex het grondig.
- Plating van bodemverdunningen op selectieve media.
- Werk onder een laminaire stroomkast en verzamel 100 μL van de 1 x 10-3 verdunning met behulp van een micropipette met een steriel punt en breng het over op een humus agar petrischaal. Doe dit voor minimaal 4 of 5 petrischaaltjes.
- Verdeel de verdunning gelijkmatig over het oppervlak van de petrischaal met behulp van een steriele L-vormige celstrooier.
- Laat het 10-15 min aan de lucht drogen onder de laminaire flowkast.
- Herhaal stap 1.4.1.-1.4.3. met behulp van lignocellulose petrischalen.
- Incubeer bij 25 °C in het donker gedurende maximaal 15 dagen.
- Isolatie van schimmelkolonies groeide van selectieve media naar groeimedia.
- Controleer vanaf 3 dagen na bereiding dagelijks de bereide selectieve media petrischalen op eventuele schimmelkoloniegroei gedurende maximaal 15 dagen.
- Controleer alle aanwezige schimmelkolonies op overeenkomsten. Bereid indien nodig een dia voor die onder een lichtmicroscoop kan worden waargenomen.
OPMERKING: Het doel is om het hoogste aantal schimmelkolonies te isoleren, maar het is noodzakelijk om te voorkomen dat steeds dezelfde schimmelstam van verschillende platen wordt geïsoleerd, dus deze controle is erg belangrijk. Zoek naar kolonies met verschillende macro- en micromorfologie. - Isoleer onder een laminaire stroomkast of bij een Bunsen-brander elke gekozen schimmelstam door voorzichtig een klein deel van het mycelium uit de kolonie te verwijderen met een steriele inentingsnaald en over te brengen naar een nieuwe MEA-petrischaal.
OPMERKING: In deze fase is het erg belangrijk om delicaat en nauwkeurig te zijn, omdat er een hoog risico is op besmetting door de andere schimmelkolonies die aanwezig zijn in de originele petrischaal. Als er meer dan één schimmelstam op de geënte MEA-plaat groeit, herhaalt u stap 1.5.3. - Incubeer bij 25 °C in het donker gedurende 7 dagen. Dit zijn de schimmelstammen die verder getest moeten worden op specifieke recalcitrante stoffen.
2. Groeiproeven op recalcitrante stoffen
- Groeitest op vaseline.
- Breng 20 ml vloeibare BH (3,26 g/l BH) over in injectieflacons van 50 ml en steriliseer ze door deze gedurende 20 minuten te autoclaveren bij 121 °C.
- Breng 7 ml gedeïoniseerd water over in glazen injectieflacons van 15 ml en voeg enkele stukjes gebroken glazen afdekplaten toe aan elke injectieflacon.
- Steriliseer ze door ze gedurende 20 minuten te autoclaveren bij 121 °C.
- Voeg onder de laminaire flowkast 1 ml vaseline toe aan elke injectieflacon bh van 50 ml met behulp van een steriele pipet. Bewaar enkele injectieflacons met alleen BH als negatieve controle.
- Verwijder onder de laminaire flowkast het mycelium op het oppervlak van het medium uit de MEA-platen met de gekozen schimmelstammen (bereid bij stap 1.5.3.) met behulp van een steriele naald en breng het over in glazen injectieflacons van 15 ml met de gebroken dekplaten.
- Roer elke injectieflacon gedurende 2 minuten op een vortexmixer, zodat de gebroken dekmantels het blokje van de schimmelkolonie kunnen snijden, waardoor een schimmelsuspensie ontstaat.
- Ent elke injectieflacon met vaseline met 200 μL schimmelsuspensie. Maak twee replicaties voor elke schimmelstam.
- Voor de negatieve controle, doe 200 μL schimmelsuspensie in flacons met alleen vloeibare BH. Bewaar bovendien een paar injectieflacons met vaseline zonder schimmelinenting om te controleren op besmetting in het medium.
- Incubeer de injectieflacons bij 25 °C in het donker en controleer ze na 15 dagen en 30 dagen vanaf het entmateriaal.
- Groeitest op gebruikte motorolie.
- Doe 3,26 g BH en 15 g agar in 1 L gedeïoniseerd water en autoclaaf het gedurende 20 minuten bij 121 °C (BHA).
- Leg de BHA in petrischaaltjes onder een laminaire flowkast.
- Wanneer het is gestold, breng dan 500 μL gebruikte motorolie over op de BHA Petrischalen en verdeel het gelijkmatig over de plaatoppervlakken met behulp van een steriele L-vormige celstrooier.
- Ent elke gebruikte motorolie BHA-plaat met elke schimmelstam en verzamel het mycelium van de platen die zijn bereid bij stap 1.5.3. Werk op een Bunsen-brander of onder een laminaire stromingskap om besmetting te voorkomen. Maak twee replicaties voor elke schimmelstam.
- Voor de negatieve controle, ent de petrischalen alleen met BHA. Bewaar bovendien een paar gebruikte BHA Petri-schalen met motorolie zonder schimmelinenting om te controleren op verontreiniging in het medium.
- Incubeer de petrischaaltjes bij 25 °C in het donker en controleer ze na 15 dagen en 30 dagen vanaf het entmateriaal.
- Groeitest op kunststoffen.
- Breng 200 μL schimmelsuspensie (stappen 2.1.5.-2.1.6.) over in een 96-microwellplaat. Maak drie replicaties van de combinatie schimmelstam-plastic.
- Voeg aan elke put met de schimmelsuspensie 10 mg van een ander soort plastic poeder toe (polyethyleentereftalaat - PET, polyvinylchloride - PVC, polyethyleen met hoge dichtheid - HDPE, polystyreen - PS, polyurethaan - PUR).
- Voor de negatieve controle, in plaats van het plastic poeder toe te voegen, voegt u 200 μL gesteriliseerde BH-oplossing toe aan de put met de schimmelsuspensie. Vul bovendien voor elk type plastic poeder een put met 200 μL gesteriliseerde BH-oplossing en 10 mg van elk plastic stof om te controleren op verontreiniging van het medium.
- Incubeer de microwellplaten bij 25 °C in het donker en controleer ze na 15 dagen en 30 dagen vanaf het entmateriaal.
3. Kwalitatieve enzymatische tests
- Kwalitatieve ligninolytische enzymen colorimetrische test.
- Doe 27 g aardappeldextrosebouillon (PD) en 15 g agar in 1 l gedeïoniseerd water en autoclaaf het gedurende 20 minuten bij 121 °C (PDA).
- Wanneer het medium een beetje is afgekoeld maar nog steeds vloeibaar is, voegt u galluszuur (5 g/L) toe onder een laminaire stromingskap en plaatst u het medium in petrischalen.
- Ent de PDA + galluszuurplaten met elke schimmelstam en verzamel het mycelium uit de platen die zijn bereid bij stap 1.5.3. Werk op een Bunsen-brander of onder een laminaire stromingskap om besmetting te voorkomen.
- Bereid als negatieve controles petrischalen met alleen PDA (geen galluszuur) en en ent ze in met de schimmelstammen (één voor elke schimmelstam), evenals een petrischaal met PDA + galluszuur en geen schimmelinenting.
- Incubeer de petrischaaltjes bij 25 °C in het donker en controleer ze na 7 dagen vanaf het entmateriaal.
- Kwalitatieve laccases colorimetrische test.
- Doe 27 g PD en 15 g agar in 1 L gedeïoniseerd water en autoclaaf het gedurende 20 minuten bij 121 °C (PDA).
- Wanneer het medium een beetje is afgekoeld maar nog steeds vloeibaar is, voeg je guaiacol (400 μL /L) toe onder een laminaire stroomkap en plaats je het in petrischalen.
- Ent de PDA + guaiacol-platen met elke schimmelstam en verzamel het mycelium van de platen die zijn bereid bij stap 1.5.3. Werk op een Bunsen-brander of onder een laminaire stromingskap om verontreiniging te voorkomen.
- Als negatieve controles, bereid petrischalen met alleen PDA (geen guaiacol) en ent ze in met de schimmelstammen (één voor elke schimmelstam), evenals een petrischaal met PDA + guaiacol en geen schimmelinenting.
- Incubeer de petrischaaltjes bij 25 °C in het donker en controleer ze na 7 dagen vanaf het entmateriaal.
- Kwalitatieve proteasen test.
- Bereid het YES-medium door toevoeging van K2HPO4 (1 g/L), KH2PO4 (0,5 g/L), MgSO4·7H2O (0,5 g/L), MnCl2·4H2O (0,001 g/L), CuCl2·2H2O (1,4 x 10-5 g/L), ZnCl2 (1,1 x 10-5 g/L), CoCl2·6H2O (2 x 10-5 g/L), Na2MoO4·2H2O (1,3 x 10-5 g/L), FeCl3·6H2O (7,5 x 10-5 g/L) en gelatine/pepton (0,02 g/L) tot gedeïoniseerd water.
- Plaats het YES-medium gedurende 10 minuten op een magneetroerder (geen warmte) met een magnetische roerstaaf in het medium.
- Wanneer alle zouten in het medium zijn opgelost, brengt u 5 ml van de oplossing over in steriele glazen injectieflacons van 20 ml en autoclaaft u deze gedurende 20 minuten bij 121 °C.
- Bereid voor de negatieve controle ongeveer 20 ml steriele glazen injectieflacons met 5 ml BH-oplossing en autoclaaf ze gedurende 20 minuten bij 121 °C.
- Breng onder een laminaire stroomkast 200 μL schimmelsuspensie (stappen 2.1.5.-2.1.6.) voor elke stam over naar de YES medium gesteriliseerde injectieflacons (maak ten minste 2 replicaties per schimmelstam). Voeg voor elke schimmelstam 200 μL van dezelfde schimmelsuspensie toe aan bh-gesteriliseerde injectieflacons om een negatieve controle te hebben.
- Incubeer de injectieflacons bij 25 °C in het donker gedurende 21 dagen en controleer ze om de 7 dagen.
- Kwalitatieve esterasen test.
- Bereid het Medium Tween 80 door pepton (10 g/L), NaCl (5 g/L), CaCl2 (0,1 g/L) en 10 ml Tween 80 tot 1 L gedeïoniseerd water toe te voegen.
- Plaats het Tween 80 medium gedurende 10 min op een magneetroerder (geen hitte) met een magneetroerbalk in het medium.
- Wanneer alles in het medium is gesmolten, breng dan 5 ml van de oplossing over in steriele glazen injectieflacons van 20 ml en autoclaaf ze gedurende 20 minuten bij 121 °C.
- Bereid voor de negatieve controle ongeveer 20 ml steriele glazen injectieflacons met 5 ml BH-oplossing en autoclaaf ze gedurende 20 minuten bij 121 °C.
- Breng onder een laminaire stroomkast 200 μL schimmelsuspensie (stappen 2.1.5.-2.1.6.) voor elke stam over naar de Tween 80 medium gesteriliseerde injectieflacons (maak ten minste 2 replicaties per schimmelstam). Voeg voor elke schimmelstam 200 μL van dezelfde schimmelsuspensie toe aan bh-gesteriliseerde injectieflacons voor negatieve controle.
- Incubeer de injectieflacons bij 25 °C in het donker gedurende 21 dagen en controleer ze om de 7 dagen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De selectieve mediamethoden (sectie 1 van het protocol) maakten het mogelijk om de rijke biodiversiteit van de bodem te screenen en de schimmels met een hoog bioremediatiepotentieel te selecteren. Met de humuszuur- en lignocellulosemedia werden meer dan 100 schimmelstammen geïsoleerd. Deze schimmels produceerden enzymen die betrokken zijn bij de biologische afbraak van natuurlijke recalcitrante materialen, die een chemische structuur hebben die lijkt op veel verontreinigende stoffen. De schimmelstammen geïsoleerd met de selectieve media hadden echter verdere screening nodig. In het bijzonder isoleerden de selectieve tests de stammen die humuszuren en lignocellulose konden afbreken, de groeitests screenden de geïsoleerde schimmels op degenen die in staat waren om een specifieke verontreinigende stof als hun enige koolstofbron te gebruiken, en de kwalitatieve enzymatische tests beschreven hun metabolische activiteiten.
De groeitests waren gericht op het schimmelvermogen om koolwaterstoffen (vaseline en gebruikte motorolie) en kunststoffen (PET, PVC, HDPE, PS, PUR) af te breken. Elk van deze stoffen werd in een test gebruikt als de enige koolstofbron voor de geselecteerde schimmelstammen. Het schimmelvermogen om deze stoffen te exploiteren werd beoordeeld als het verschil in koloniegroei tussen de monsters met de toegevoegde stof en de controlemonsters met slechts minimaal medium (BH of BHA, afhankelijk van de test). Een kwalitatieve schaal werd gebruikt om de resultaten te beschrijven (figuur 1), variërend van de afwezigheid van groeiverschil met de controle (0) tot lage (+), gemiddelde (++) en hoge (+++) niveaus van verschil in groei.
Figuur 1: Groeisucces van schimmelstammen in de groeitesten. Het percentage schimmelstammen dat kan groeien op vaseline, gebruikte motorolie en plastic poeders (polyethyleentereftalaat, PET; polyvinylchloride, PVC; polyethyleen met hoge dichtheid, HDPE; polystyreen, PS; polyurethaan, PUR) als hun enige koolstofbron met verschillende gradaties van succes (geen groei, 0; lage groei, +; gemiddelde groei, ++; hoge groei, +++). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De petrolatum- en gebruikte motorolietests evalueerden het koolwaterstofbiodegradatiepotentieel van de geselecteerde schimmelstammen. Vaseline, een mengsel van lange-keten alkanen (>C25), werd gebruikt als de enige koolstofbron. Het schimmelvermogen om deze stof te exploiteren werd geëvalueerd als het verschil in koloniegroei tussen injectieflacons met BH + vaseline en controleflacons met alleen BH (figuur 2). Bijna 75% van de geteste schimmelstammen was in staat om vaseline als enige koolstofbron te gebruiken en 21% van de stammen vertoonde maximale groei (+++, figuur 1).
Figuur 2: Foto's van de kwalitatieve groeischaal op vaseline als enige koolstofbron. De kwalitatieve schaal is gebaseerd op het groeiverschil tussen de behandelde monsters en bh-controle. Het varieert van de afwezigheid van groeiverschil (0), tot lage (+), gemiddelde (++) en hoge (+++) niveaus van groeiverschil. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Gebruikte motorolie is een complex mengsel van koolwaterstoffen, motoradditieven en metalen. Het werd gebruikt in de groeitests om het schimmelvermogen te evalueren om een complex en giftig koolwaterstofmengsel als koolstofbron te gebruiken. Net als de andere groeitests werd de groei geëvalueerd door de schimmelgroei in platen met de motorolie te vergelijken met de groei in de controleplaten die alleen BHA bevatten (figuur 3). De groeiresultaten bevestigden de werkzaamheid van de selectieve media (rubriek 1 van het protocol). Inderdaad, bijna 90% van de geïsoleerde schimmelstammen kon groeien op gebruikte motorolie, waarbij 39% maximale groei vertoonde (+++, figuur 1).
Figuur 3: Foto's van de kwalitatieve groeischaal van gebruikte motorolie als enige koolstofbron. De kwalitatieve schaal is gebaseerd op het groeiverschil tussen de behandelde monsters en BHA-controle. Het varieert van afwezigheid van groeiverschil (0), tot lage (+), gemiddelde (++) en hoge (+++) niveaus van groeiverschil. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Groeitests op plastic poeders werden gebruikt om de schimmelstammen te selecteren die specifieke plastic polymeren als hun primaire koolstofbron konden gebruiken; vandaar dat deze stammen een hoog potentieel hebben voor plastic bioremediatie. De groei in multiwell-platen werd waargenomen door stereomicroscoop en geëvalueerd met behulp van een kwalitatieve schaal, variërend van de afwezigheid van groei (0) tot hoge productie van schimmeldraden (+++). PUR was het plastic poeder met het hoogste percentage schimmelstammen dat groei vertoonde (92%), met 31% van de stammen met maximale groei (+++). Ongeveer 70% van de stammen geïsoleerd uit humuszuur en lignocellulose media groeide op PS-poeder, terwijl bijna 60% -65% van hen HDPE, PVC en PET als enige koolstofbron kon gebruiken. Daarom was een groot percentage schimmels in staat om te groeien op de verschillende plastic poeders in multiwell-platen, maar een zeer laag aantal van hen vertoonde een hoge kolonisatie van kunststoffen. Inderdaad, slechts 10% van de stammen was in staat om te gedijen op PET en HDPE, en 13% was in staat om te gedijen op PS. Het enige plastic waar regelmatig een hoge schimmelgroei werd waargenomen was PUR, waarop ongeveer 30% van de schimmelstammen zeer overvloedig wist te groeien.
Kwalitatieve enzymatische tests werden uitgevoerd om schimmelstammen te detecteren die enzymen kunnen produceren die betrokken zijn bij de biologische afbraakprocessen van recalcitrante stoffen. Peroxidasen en laccases zijn ligninolytische enzymen waarvan de productie wordt aangegeven door een bruinachtige halo aan de onderkant van het medium in galluszuur- en guaiacoltests (stap 3.1. en stap 3.2. van het protocol). In beide tests duidde de toename van de intensiteit van de kleur op een hogere productie van deze enzymen (figuur 4).
Figuur 4: Afbeeldingen van de kwalitatieve schaal van kwalitatieve ligninolytische enzymen. De kwalitatieve schaal is gebaseerd op de productie van een rood/bruinachtig aureool rond de kolonie. 0 = geen activiteit, + = enige activiteit, ++ = hoge activiteit, +++ zeer hoge activiteit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Ongeveer 60% van de geteste schimmels was in staat om ligninolytische enzymen te produceren, wat wijst op het succes van de selectieve media. Bovendien produceerde 12% van de geïsoleerde schimmelstammen een intens donker aureool rond de kolonie (+++) in galluszuurmedium, waarbij 17% dit deed in guaiacolmedium (laccases), wat wijst op een hoge schimmelsecretie van deze enzymen (figuur 5).
Figuur 5: Snelheid van enzymactiviteit door schimmelstammen tijdens kwalitatieve enzymatische tests. Het percentage schimmelstammen dat ligninolytische enzymen, laccases, proteasen en esterasen kan produceren met verschillende niveaus van succes (0 = geen activiteit, + = activiteit, ++ = hoge activiteit, +++ zeer hoge activiteit) tijdens hun overeenkomstige kwalitatieve enzymatische tests. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Een andere screeningstest die werd gebruikt om schimmelactiviteit te analyseren, was de proteasentest, die was gebaseerd op het verschil in schimmelgroei tussen YES-mediumflacons en controleflacons met BH. Ongeveer 70% van de schimmelstammen in het YES-medium vertoonde echter een vergelijkbare groei als controles, of zelfs verminderde groei. Geen enkele schimmelstam bereikte het maximale verschilniveau (+++). Deze resultaten suggereren dat deze test mogelijk niet geschikt is voor screening op protease-activiteit.
Ten slotte werd de esteraseactiviteit geëvalueerd door de vorming van een wit neerslag in tween 80 medium (figuur 5). Bijna 60% van de geselecteerde schimmelstammen vertoonde esterase-activiteit en 13% vertoonde een hoge vorming van het neerslag (+++), wat suggereert dat de stammen in de 13% moeten worden geselecteerd om hun biologische afbraakpotentieel te onderzoeken (figuur 5).
Met betrekking tot alle groei- en enzymatische tests waren de meest succesvolle stammen (d.w.z. degenen die +++ in ten minste één test verkregen) het meest interessant. Deze schimmelstammen waren in staat om recalcitrante stoffen efficiënt te gebruiken als hun enige koolstofbron, of ze produceerden een hoog niveau van enzymen die betrokken zijn bij de biologische afbraak van recalcitrante stoffen. Inderdaad, 39 van de 115 geteste schimmelstammen waren in staat om te gedijen (+++) op koolwaterstofbronnen (vaseline of gebruikte motorolie), en 58 hadden een hoge groei op ten minste één plastic polymeer. Slechts 32 vertoonden een zeer hoge enzymatische activiteit (+++) in ten minste één van de uitgevoerde enzymatische tests. Deze resultaten tonen de hoge werkzaamheid van alle gerapporteerde screeningstests, afgezien van de proteasentest, die geen goed presterende stammen selecteerde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De rijke biodiversiteit van de bodem is een overvloedige bron van schimmels die tal van metabolische vermogens bezitten, waarvan sommige potentiële kandidaten voor bioremediatie kunnen zijn. Selectieve mediatests (sectie 1 van het protocol) zijn eenvoudig uit te voeren en effectieve methoden voor het isoleren van schimmels die kunnen groeien op natuurlijke complexe polymeren als hun enige koolstofbron. Schimmels kunnen extracellulaire, niet-specifieke hydrolasen en oxidoreductasen30 produceren, zoals de ligninolytische enzymen laccases en peroxidasen31. Deze enzymen kunnen lignocellulose en humuszuren afbreken, maar ook veel verschillende xenobiotica, waaronder koolwaterstoffen, aromatische verbindingen en gechloreerde organische verbindingen32.
De beschreven methoden leveren resultaten op die gemakkelijk te interpreteren zijn en goedkoop zijn om uit te voeren. Met deze kenmerken kunnen ze door niet-experts worden gebruikt. Bepaalde aspecten, zoals steriliteit en morfologische identificatie, vereisen echter speciale aandacht. Het roeren van de grondsuspensie van 30 minuten (stap 1.3.4.) is bijvoorbeeld noodzakelijk zodat de schimmelsporen en propagules worden bevrijd van de bodemmicrostructuur en in de oplossing kunnen worden gesuspendeerd. Op deze manier is het door verdunningen van deze bodemsuspensie te plateren mogelijk om het maximale aantal schimmelstammen te isoleren. Macro- en microscopische morfologische identificatie van schimmelstammen zijn belangrijk om onderscheid te maken tussen stammen en te voorkomen dat dezelfde schimmelstam meerdere keren wordt geïsoleerd. Bovendien zijn steriliteit en het vermijden van microbiële besmettingen cruciaal omdat de aanwezigheid van andere actieve schimmelstammen de activiteit van de bestudeerde kolonies verkeerd kan voorstellen.
Na de selectieve tests werd een reeks groeitests uitgevoerd op verschillende recalcitrante stoffen, zoals vaseline, gebruikte motorolie en verschillende plastic polymeren. Deze fase kan worden aangepast aan de recalcitrante stoffen van belang. De belangrijke stap is om de geselecteerde stof toe te voegen aan BH of BHA als enige koolstofbron en om de schimmelgroei te controleren tegen een bestrijding zonder de toegevoegde recalcitrante stof.
Het doel van de groeitests op kunststoffen en koolwaterstoffen was om te beoordelen of de schimmel deze stoffen als enige koolstofbron kon gebruiken door zijn groei op het materiaal kwalitatief te observeren. Helaas is het vanwege de extreme recalcitrantie van deze materialen erg moeilijk om de werkelijke afname van het gewicht van het substraat en de toename van het gewicht van de schimmelbiomassa te kwantificeren, vooral na een relatief korte tijd. Als een schimmelstam zeer goed presteert in deze screeningsgroeitests, moet verder onderzoek worden uitgevoerd om de afbraak van de recalcitrante stof te kwantificeren.
De gebruikte enzymatische tests (sectie 3 van het protocol) werden gekozen omdat ze efficiënt en snel uit te voeren bleken te zijn, maar ze produceren alleen kwalitatieve resultaten. Ze benadrukken het afbraakpotentieel van een schimmelstam, maar ze kunnen het niet precies kwantificeren. Als een stam van bijzonder belang wordt geïsoleerd, kunnen verdere tests, zoals spectrofotometrische kwantitatieve enzymessays, worden uitgevoerd om de metabole activiteit nauwkeuriger te beschrijven. De enige enzymatische test die suboptimale werkzaamheid aantoonde, was de kwalitatieve proteasentest, met een laag aantal stammen die op het YES-medium konden groeien. Inderdaad, het hoge percentage stammen dat op PUR kan groeien, suggereert dat de schimmels proteasen produceerden die betrokken waren bij het verbreken van de amide- en urethaanbindingen, waarbij esterase zich richtte op de esterbindingen40. De bijna volledige afwezigheid van protease-producerende schimmels suggereert dat er mogelijk een probleem was in de gebruikte methode. Andere tests kunnen worden toegepast voor protease-activiteit, zoals caseïne41, magere melk42 of melkpoeder43 agarplaattests. De galluszuurtest bleek zeer nuttig te zijn voor het detecteren van de productie van ligninolytische enzymen, maar helaas was deze niet erg specifiek en kon het type geproduceerde ligninolytische enzym (peroxidasen of laccases) niet onderscheiden.
De resultaten van dit werk suggereren dat het gebruik van lignocellulose of humuszuren als selectieve media het mogelijk maakt schimmelstammen met bioremediatiepotentieel te isoleren uit de rijke bodembiodiversiteit. Inderdaad, meer dan 70% van de schimmelstammen geïsoleerd door de selectieve methoden waren in staat om te groeien op vaseline of gebruikte motorolie, en 60% was in staat om te groeien op verschillende plastic polymeren als de enige koolstofbron. Bovendien beschreven de kwalitatieve enzymatische tests de metabole activiteit van deze schimmels gekoppeld aan biologische afbraakprocessen. De selectie van schimmelstammen die +++ activiteit vertonen in een of meer tests wordt aanbevolen omdat het de kans vergroot op het vinden van een schimmelstam die zeer actief is in bioremediatie. Tests met behulp van gasmassachromatografie (GC-MS) op de recalcitrante stoffen na langdurig contact met de schimmelstammen die met onze screeningstests zijn geselecteerd, hebben de werkelijke biologische afbraak van de materialen aangetoond 9,44. Het gebruik van deze eenvoudige screeningstests in verschillende ecosystemen zal het mogelijk maken om de biodiversiteit van schimmels in verschillende bodems te onderzoeken. Het zoeken naar schimmels die recalcitrante materialen kunnen afbreken, zal het aantal geïdentificeerde stammen die het potentieel hebben voor bioremediatie vergroten en helpen het groeiende probleem van milieuvervuiling aan te pakken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We erkennen Scuola di Alta Formazione Dottorale (SAFD) van de Universiteit van Pavia en professor Solveig Tosi voor het bieden van de mogelijkheid voor dit werk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 microwell plate | Greiner bio-one | 650185 | |
| Agar | VWR | 84609.05 | |
| Bushnell-Haas Broth | Fluka | B5051 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Chloroamphenicol | Eurobio | GABCRL006Z | |
| Chlortetracycline | Sigma-Aldrich | Y0001451 | |
| CoCl2·6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| CuCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | C3279 | |
| Ethanol | VWR Chemicals | 20821.296 | |
| FeCl3·6H2O | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| Filter 0.2 µm | Whatman | 10462200 | |
| gallic acid | Sigma-Aldrich | G7384 | |
| Glass cover slips | Biosigma | VBS634 | |
| Glass vials 15 mL | SciLabware | P35467 | |
| guaiacol | Sigma-Aldrich | G5502 | |
| High-density polyethylene (HDPE) | Sigma-Aldrich | 434272 | |
| Humic acids | Aldrich Chemistry | 53680 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P8281 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Lignocellulose | / | / | Sterilized bioethanol production waste |
| L-shaped cell spreader | Laboindustria S.p.a | 21133 | |
| magnetic stirrer | A.C.E.F | 8235 | |
| Malt Extract Broth | Sigma-Aldrich | 70146 | |
| MgSO4·7H2O | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| Micropipette 1000 μL | Gilson | FA10006M | |
| Micropipette 200 μL | Gilson | FA10005M | |
| MnCl2·4H2O | Sigma-Aldrich | M5005 | |
| Na2MoO4·2H2O | Sigma-Aldrich | M1651 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Neomycin | Sigma-Aldrich | N0401000 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | 1504489 | |
| peptone | Sigma-Aldrich | 83059 | |
| Polyethylene terephthalate (PET) | Goodfellow | ES306031 | |
| Petri dishes | Laboindustria S.p.a | 21050 | |
| Petrolatum (Paraffin liquid) | A.C.E.F | 009661 | |
| Potato Dextrose Broth | Sigma-Aldrich | P6685 | |
| Polystyrene (PS) | Sigma-Aldrich | 331651 | |
| Polyurethane (PUR) | Sigma-Aldrich | GF20677923 | |
| Polyvinyl chloride (PVC) | Sigma-Aldrich | 81388 | |
| Sterile falcon tube | Greiner bio-one | 227 261 | |
| Sterile glass vials 20 mL | Sigma-Aldrich | SU860051 | |
| Sterile point 1000 μL | Gilson | F172511 | |
| Sterile point 200 μL | Gilson | F172311 | |
| Sterile polyethylene bags | WHIRL-PAK | B01018 | |
| sterile syringe | Rays | 5523CM25 | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S-6501 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | |
| Used engine oil | / | / | complex mixture of hydrocarbons, engine additives, and metals, provided by an Italian private company |
| Vials 50 mL | Sigma-Aldrich | 33108-U | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | Z0152 |
References
- Mohammadi, K., Heidari, G., Khalesro, S., Sohrabi, Y. Soil management, microorganisms and organic matter interactions: A review. African Journal of Biotechnology. 10 (86), 19840-19849 (2011).
- Daccò, C., Girometta, C., Asemoloye, M. D., Carpani, G., Picco, A. M., Tosi, S. Key fungal degradation patterns, enzymes and their applications for the removal of aliphatic hydrocarbons in polluted soils: A review. International Biodeterioration and Biodegradation. 147, (2020).
- Asemoloye, M. D., Ahmad, R., Jonathan, S. G. Synergistic action of rhizospheric fungi with Megathyrsus maximus root speeds up hydrocarbon degradation kinetics in oil polluted soil. Chemosphere. 187, 1-10 (2017).
- Abatenh, E., Gizaw, B., Tsegaye, Z., Wassie, M. The role of microorganisms in bioremediation - A review. Open Journal of Environmental Biology. 2, 038-046 (2017).
- Dix, N. J., Webster, J. Fungal Ecology. , Chapman & Hall. Cambridge, UK. (1995).
- Magan, N. Fungi in extreme environment. Environmental and Microbial Relationships. The Mycota. Esser, K., Lemke, P. A. 4, Springer. Berlin, Heidelberg. 99-114 (2007).
- Aranda, E. Promising approaches towards biotransformation of polycyclic aromatic hydrocarbons with Ascomycota fungi. Current Opinion in Biotechnology. 38, 1-8 (2016).
- Hasan, I. F., AI-Jawhari, Role of Filamentous Fungi to Remove Petroleum Hydrocarbons from the Environment. Microbial Action on Hydrocarbons. Kumar, V., Kumar, M., Prasad, R. , Springer. Singapore. (2018).
- Daccò, C., et al. Trichoderma: evaluation of its degrading abilities for the bioremediation of hydrocarbon complex mixtures. Applied Sciences. 10 (9), 3152 (2020).
- Alarcón, A., Davies, F. T., Autenrieth, R. L., Zuberer, D. A. Arbuscular mycorrhiza and petroleum-degrading microorganisms enhance phytoremediation of petroleum-contaminated soil. International Journal of Phytoremediation. 10, 251-263 (2008).
- Mancera-López, M. E., et al. Bioremediation of an aged hydro-carbon-contaminated soil by a combined system of biostimulation-bioaugmentation with filamentous fungi. International Biodeterioration and Biodegradation. 61, (2008).
- Hatami, E., Abbaspour, A., Dorostkar, V. Phytoremediation of a petroleum-polluted soil by native plant species in Lorestan Province, Iran. Environmental Science and Pollution Research. 26, 24323-24330 (2019).
- Prenafeta-Boldú, F. X., De Hoog, G. S., Summerbell, R. C. Fungal communities in hydrocarbon degradation. Microbial Communities Utilizing Hydrocarbons and Lipids: Members, Metagenomics and Ecophysiology. Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology. , Springer. Cham. 1-36 (2018).
- Gu, J., Ford, T., Mitton, D., Mitchell, R. Microbiological degradation of polymeric materials. Uhlig's Corrosion Handbook. , John Wiley and Sons. 421-438 (2011).
- Tuomela, M., Hatakka, A. Oxidative fungal enzymes for bioremediation. Comprehensive Biotechnology: Environmental and Related Biotechnologies. 6, Elsevier. 224-239 (2019).
- DSouza, G. C., et al. Fungal biodegradation of low-density polyethylene using consortium of Aspergillus species under controlled conditions. Heliyon. 7 (5), 07008 (2021).
- El-Sayed, M. T., Rabie, G. H., Hamed, E. A. Biodegradation of low-density polyethylene (LDPE) using the mixed culture of Aspergillus carbonarius and A. fumigates. Environment, Development, and Sustainability. 23 (10), 14556-14584 (2021).
- Sepperumal, U., Markandan, M., Palraja, I. Micromorphological and chemical changes during biodegradation of polyethylene terephthalate (PET) by Penicillium sp. Journal of Microbiology and Biotechnology Research. 3 (4), 47-53 (2013).
- Leitão, A. L. Potential of Penicillium species in the bioremediation field. International Journal of Environmental Research and Public Health. 6 (4), 1393-1417 (2009).
- Chen, S. H., Ting, A. S. Y. Biosorption and biodegradation potential of triphenylmethane dyes by newly discovered Penicillium simplicissimum isolated from indoor wastewater sample. International Biodeterioration & Biodegradation. 103, 1-7 (2015).
- Orhan, Y., Buyukgungor, H. Enhancement of biodegradability of disposable polyethylene in controlled biological soil. International Biodeterioration and Biodegradation. 45, 49-55 (2000).
- Deshmukh, R., Khardenavis, A. A., Purohit, H. J. Diverse metabolic capacities of fungi for bioremediation. Indian journal of microbiology. 56 (3), 247-264 (2016).
- Viswanath, B., Rajesh, B., Janardhan, A., Kumar, A. P., Narasimha, G. Fungal laccases and their applications in bioremediation. Enzyme research. 2014, 163242 (2014).
- Ali, M., Husain, Q., Ishqi, H. M. Fungal peroxidases mediated bioremediation of industrial pollutants. Fungal Bioremediation. , CRC Press. Boca Raton. (2019).
- Nousiainen, P., Kontro, J., Manner, H., Hatakka, A., Sipilä, J. Phenolic mediators enhance the manganese peroxidase catalyzed oxidation of recalcitrant lignin model compounds and synthetic lignin. Fungal Genetics and Biology. 72, 137-149 (2014).
- Srivastava, S., Kumar, M. Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs): A sustainable approach. Sustainable Green Technologies for Environmental Management. , Springer. Singapore. (2019).
- Wei, R., Zimmermann, W. Microbial enzymes for the recycling of recalcitrant petroleum-based plastics: how far are we. Microbial Biotechnology. 10 (6), 1308-1322 (2017).
- Matsubara, M., Lynch, J. M., De Leij, F. A. A. M. A simple screening procedure for selecting fungi with potential for use in the bioremediation of contaminated land. Enzyme and Microbial Technology. 39 (7), 1365-1372 (2006).
- Mann, J., et al. Screening and selection of fungi for bioremediation of olive mill wastewater. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 26 (3), 567-571 (2010).
- Andlar, M., Rezić, T., Marđetko, N., Kracher, D., Ludwig, R., Šantek, B. Lignocellulose degradation: an overview of fungi and fungal enzymes involved in lignocellulose degradation. Engineering in Life Sciences. 18, 768-778 (2018).
- Goméz-Toribio, V., García-Martín, A. B., Martínez, M. J., Martínez, A. T., Guillén, F. Induction of extracellular hydroxyl radical production by white-rot fungi through quinone redox cycling. Applied and Environmental Microbiology. 75, 3944-3953 (2009).
- Belcarz, A., Ginalska, G., Kornillowicz-Kowalska, T. Extracellular enzyme activities of Bjerkandera adusta R59 soil strain, capable of daunomycin and humic acids degradation. Applied Microbiology and Biotechnology. 68 (5), 686-694 (2005).
- Stevenson, F. J. Humus Chemistry: Genesis, Composition, Reactions. 2nd ed. , Wiley. New York. (1995).
- Andlar, M., et al. Lignocellulose degradation: An overview of fungi and fungal enzymes involved in lignocellulose degradation. Engineering in Life Sciences. 18 (11), 768-778 (2018).
- Lee, H., et al. Biotechnological procedures to select white rot fungi for the degradation of PAHs. Journal of Microbiological Methods. 97 (1), 56-62 (2014).
- Batista-García, R. A., et al. Simple screening protocol for identification of potential mycoremediation tools for the elimination of polycyclic aromatic hydrocarbons and phenols from hyperalkalophile industrial effluents. Journal of Environmental Management. 198, 1-11 (2017).
- Shleev, S. V., et al. Comparison of physico-chemical characteristics of four laccases from different basidiomycetes. Biochimie. 86 (9-10), (2004).
- Kiiskinen, L. L., Rättö, M., Kruus, K. Screening for novel laccase-producing microbes. Journal of Applied Microbiology. 97, (2004).
- Kumar, V. V., Rapheal, V. S. Induction and purification by three-phase partitioning of aryl alcohol oxidase (AAO) from Pleurotus ostreatus. Applied Biochemistry and Biotechnology. , 163 (2011).
- Loredo-Treviño, A., Gutiérrez-Sánchez, G., Rodríguez-Herrera, R., Aguilar, C. N. Microbial enzymes involved in polyurethane biodegradation: a review. Journal of Polymers and the Environment. 20 (1), 258-265 (2012).
- Garriga, M., et al. Technological and sensorial evaluation of Lactobacillus strains as starter cultures in fermented sausages. International Journal of Food Microbiology. 32 (1-2), 173-183 (1996).
- Zerdani, I., Faid, M., Malki, A. Feather wastes digestion by new isolated strains Bacillus sp. In microcco. African Journal of Biotechnology. 3 (1), 67-70 (2004).
- Nygren, C. M., Edqvist, J., Elfstrand, M., Heller, G., Taylor, A. F. Detection of extracellular protease activity in different species and genera of ectomycorrhizal fungi. Mycorrhiza. 17 (3), 241-248 (2007).
- Asemoloye, M. D., et al. Hydrocarbon degradation and enzyme activities of Aspergillus oryzae and Mucor irregularis isolated from Nigerian crude oil-polluted sites. Microorganisms. 8 (12), 1912 (2020).
