Målrettet laserablation i embryoet af Saccharina latissima
Summary
Ødelæggelsen af specifikke celler i embryoet er et kraftfuldt værktøj til at studere cellulære interaktioner involveret i celle skæbne. Den nuværende protokol beskriver teknikker til laserablation af målrettede celler i det tidlige embryo af den brune alge Saccharina latissima.
Abstract
I Saccharina latissima udvikler embryoet sig som et enlags celleark kaldet lamina eller bladet. Hver embryocelle er let at observere, let at skelne fra sine naboer og kan målrettes individuelt. I årtier er laserablation blevet brugt til at studere embryoudvikling. Her blev der udviklet en protokol for cellespecifik laserablation til tidlige embryoner af den brune alge S. latissima. Det præsenterede arbejde omfatter: (1) fremstilling af Saccharina-embryoner med en beskrivelse af de kritiske parametre, herunder kulturbetingelser, (2) laserablationsindstillingerne og (3) overvågning af den efterfølgende vækst af det bestrålede embryo ved hjælp af timelapse-mikroskopi. Derudover gives detaljer om de optimale betingelser for transport af embryonerne fra billeddannelsesplatformen tilbage til laboratoriet, hvilket kan påvirke den efterfølgende embryoudvikling dybt. Alger, der tilhører ordenen Laminariales, viser embryogenesemønstre svarende til Saccharina; denne protokol kan således let overføres til andre arter i denne taxon.
Introduction
Laserablation er blevet brugt i årtier til at studere embryoudvikling. Bestråling af embryoceller med en laserstråle gør det muligt at overvåge det regenerative potentiale og modifikationen af celleslægten under embryogenese og undersøge virkningen af målrettet ablation på celledeling og celleskæbne. De modelorganismer, der anvendes i laserablationsmetoder, er typisk dyr, såsom insekter 1,2, nematoder 3,4, hvirveldyr 5,6 og lejlighedsvis planter 7,8. Derudover blev en lasermikroablationsmetode anvendt på den brune alge Fucus i 1994 og 1998 for at demonstrere cellevæggens rolle i fotopolariseringen af det tidlige embryo 9,10.
Brune alger tilhører gruppen Stramenopiles, divergerede ved roden af det eukaryote træ for 1,6 milliarder år siden. Som følge heraf er de fylogenetisk uafhængige af andre flercellede organismer, såsom dyr og planter11. Saccharina latissima tilhører ordren Laminariales, mere almindeligt kendt som kelps, og de er blandt de største organismer på jorden og når størrelser på over 30 m. Saccharina sp. er en stor tang, der anvendes til mange anvendelser såsom mad og foder, og dets polysaccharider ekstraheres til brug i landbrugs-, farmakologiske og kosmetiske industrier over hele verden12, 13. Dens dyrkning, hovedsagelig i Asien og for nylig i Europa, kræver forberedelse af embryoner i rugerier, inden unge frigives i det åbne hav. Som alle tang har den en bifasisk livscyklus sammensat af en mikroskopisk gametofytisk fase, hvor en haploid gametofyt vokser og producerer gameter til befrugtning og en diploid makroskopisk sporofytisk fase, hvor et stort plant blad udvikler sig fra sin holdfast fastgjort til havbunden eller klipperne. Sporofytten frigiver haploide sporer ved modenhed og fuldender derved livscyklussen 14,15,16.
S. latissima præsenterer nogle interessante morfologiske træk17. Dets embryo udvikler sig som et enkeltlags planark 15,18,19, før det erhverver en flerlagsstruktur, der falder sammen med fremkomsten af forskellige vævstyper. Derudover er Laminariales en af de eneste taxa af brune alger, hvis embryoner forbliver bundet til deres moderlige gametofytiske væv (Desmarestiales og Sporochnales gør også15). Denne funktion giver mulighed for at studere moderens vævs rolle i denne udviklingsproces og sammenligne moderlige kontrolmekanismer i brune alger med dem hos dyr og planter.
Denne artikel præsenterer den første komplette protokol for laserablation i et tidligt kelpembryo. Denne protokol, der involverer UV ns-pulserende teknik, resulterer i specifik destruktion af individuelle embryoceller for at studere deres respektive roller under embryogenese. Proceduren tilbyder en pålidelig tilgang til undersøgelse af celleinteraktioner og celle skæbne under embryogenese i Laminariales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lokal cellulær laserablation giver mulighed for tidsmæssig og rumlig ablation med et højt præcisionsniveau. Dets effektivitet kan imidlertid hæmmes af målcellernes manglende tilgængelighed; for eksempel er alle cellerne af et tredimensionelt embryo. Denne protokol blev udviklet på embryoet af algen Saccharina latissima, som udvikler en enlags lamina, hvor alle celler let kan skelnes og ødelægges individuelt med en laserstråle.
Laserkraft og bølgelængde<br…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.B.’s ph.d.-stipendium er finansieret af Region Bretagne (ARED-bevillingsnummer COH20020) og Sorbonne Université. I.T.is ph.d.-stipendium er finansieret af Region Bretagne (ARED-tilskudsnummer COH18020) og Norvegian NMBU University. Dette projekt har modtaget økonomisk støtte fra CNRS gennem MITI tværfaglige programmer. MRic er medlem af den nationale infrastruktur France-BioImaging støttet af det franske nationale forskningsagentur (ANR-10-INBS-04).
Materials
| 25 mm glass bottom petri dish | NEST | 801001 | |
| Autoclaved sea water | – | Collected offshore near the Astan buoy (48°44.934 N 003°57.702 W) close to Roscoff, France, at a depth of 20 m. | |
| Cell scraper | MED 2 | 83.3951 | |
| Cell strainer 40 µm | Corning / Falcon | 352340 | |
| Culture cabinets | Snijders Scientific Plant Growth Cabinet ECD01 | Any other brand is suitable provided that the light intensity, the photoperiod and the temperature can be controlled. | |
| LSM 880 Zeiss confocal microscope | Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany | Ablation and imaging were performed using a 40x/1.2 water objective | |
| Pellet pestles | Sigma Aldrich | Z359947 | Blue polypropylene (autoclavable) |
| Provasoli supplement | – | Recipe is available here: http://www.sb-roscoff.fr/sites/www.sb-roscoff.fr/files/documents/station-biologique-roscoff-preparation-du-provasoli-2040.pdf | |
| Pulsed 355 laser (UGA-42 Caliburn 355/25) | Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany | ||
| Scalpel | Paramount | PDSS 11 | |
| SysCon software | Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany | Laser-driver software | |
| ZEN software | Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany | Imaging software, used together with the SysCon software; Black 2.3 version |
References
- Montell, D. J., Keshishian, H., Spradling, A. C. Laser ablation studies of the role of the Drosophila oocyte nucleus in pattern formation. Science. 254 (5029), 290-293 (1991).
- Shivakumar, P. C., Lenne, P. F. Laser ablation to probe the epithelial mechanics in drosophila. Methods In Molecular Biology. 1478, 241-251 (2016).
- Bargmann, C. I., Avery, L. Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Modern Biological Analysis of an Organism. 48, 225-250 (1995).
- Fouad, A. D., Liu, A., Du, A., Bhirgoo, P. D., Fang-Yen, C. Thermal laser ablation with tunable lesion size reveals multiple origins of seizure-like convulsions in Caenorhabditis elegans. Scientific Reports. 11 (1), 5084 (2021).
- Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. Journal of Visualized Experiments. (54), e2845 (2011).
- Mondia, J. P., Adams, D. S., Orendorff, R. D., Levin, M., Omenetto, F. G. Patterned femtosecond-laser ablation of Xenopus laevis melanocytes for studies of cell migration, wound repair, and developmental processes. Biomedical Optics Express. 2 (8), 2383-2391 (2011).
- Reinhardt, D., Frenz, M., Mandel, T., Kuhlemeier, C. Microsurgical and laser ablation analysis of leaf positioning and dorsoventral patterning in tomato. Development. 132 (1), 15-26 (2005).
- Berg, C., Hage, W., Weisbeek, P., Scheres, B. Laser ablation in Arabidopsis roots: a tool to study cell-to-cell communication. Cellular integration of signalling pathways in plant development. Proceedings of the NATO Advanced Study Institute. , 237-250 (1998).
- Berger, F., Taylor, A., Brownlee, C. Cell fate determination by the cell wall in early fucus development. Science. 263 (5152), 1421-1423 (1994).
- Bouget, F. Y., Berger, F., Brownlee, C. Position dependent control of cell fate in the Fucus embryo: role of intercellular communication. Development. 125 (11), 1999-2008 (1998).
- Bringloe, T., et al. Phylogeny and evolution of the brown algae. Critical Reviews in Plant Sciences. 39 (4), 281-321 (2020).
- Saifullah, S., Olsen, Y., Surilayani, D., Handå, A. Carbohydrate of the brown seaweed, saccharina latissima: a review. Joint proceedings of the 2nd and the 3rd International Conference on Food Security Innovation (ICFSI 2018-2019). , 180-182 (2021).
- Zhang, X., Thomsen, M. Techno-economic and environmental assessment of novel biorefinery designs for sequential extraction of high-value biomolecules from brown macroalgae Laminaria digitata, Fucus vesiculosus, and Saccharina latissima. Algal Research. 60, 102499 (2021).
- Kanda, T. On the gametophytes of some japanese species of laminariales. Scientific papers of the Institute of Algological Research, Faculty of Science. 1 (2), 221-260 (1936).
- Fritsch, F. E. . The structure and reproduction of the algae. Volume 2. , (1945).
- Bartsch, I., et al. The genus Laminaria sensu lato : recent insights and developments. European Journal of Phycology. 43 (1), 1-86 (2008).
- Theodorou, I., Charrier, B., Boutet, A., Schierwater, B. Chapter 2: Brown algae: ectocarpus and saccharina as experimental models for developmental biology. Handbook of Marine Model Organisms in Experimental Biology – Established and Emerging. , 485 (2021).
- Drew, G. H. The reproduction and early development of laminaria digitata and laminaria saccharina. Annals of Botany. 24 (1), 177-189 (1910).
- Yendo, K. The development of costaria, undaria, and laminaria. Annals of Botany. 25 (99), 691-715 (1911).
- Forbord, S., Steinhovden, K., Rød, K., Handå, A., Skjermo, J., Charrier, B., Wichard, T., Reddy, C. R. K. Cultivation protocol for Saccharina latissima. Protocols for Macroalgae Research. , 37-59 (2018).
- Bartsch, I., Charrier, B., Wichard, T., Reddy, C. R. K. Derivation of clonal stock cultures and hybridization of kelps. Protocols for Macroalgae Research. , 61-78 (2018).
- Theodorou, I., Opsahl-Sorteberg, H. -. G., Charrier, B. Preparation of zygotes and embryos of the kelp saccharina latissima for cell biology approaches. Bio-protocol. 101, 4132 (2021).
- Lüning, K., Dring, M. J. Reproduction induced by blue light in female gametophytes of Laminaria saccharina. Planta. 104 (3), 252-256 (1972).
- de Medeiros, G., et al. Cell and tissue manipulation with ultrashort infrared laser pulses in light-sheet microscopy. Scientific Reports. 10 (1), 1942 (2020).
- Liang, X., Michael, M., Gomez, G. A. Measurement of mechanical tension at cell-cell junctions using two-photon laser ablation. Bio-protocol. 6 (24), 2068 (2016).
- Ebbing, A., Pierik, R., Bouma, T., Kromkamp, J. C., Timmermans, K. How light and biomass density influence the reproduction of delayed Saccharina latissima gametophytes (Phaeophyceae). Journal of Phycology. 56 (3), 709-718 (2020).
- Rabillé, H., Billoud, B., Tesson, B., Le Panse, S., Rolland, &. #. 2. 0. 1. ;., Charrier, B. The brown algal mode of tip growth: Keeping stress under control. PLoS Biology. 17 (1), 2005258 (2019).
