사카리나 라티시마 배아의 표적 레이저 절제
Summary
배아에서 특정 세포의 파괴는 세포 운명과 관련된 세포 상호 작용을 연구하기위한 강력한 도구입니다. 본 프로토콜은 갈색 알가 사카리나 라티시마의 초기 배아에서 표적화된 세포의 레이저 절제술을 위한 기술을 기술한다.
Abstract
Saccharina latissima에서 배아는 lamina 또는 블레이드라고 불리는 단층 세포 시트로 발전합니다. 각 배아 세포는 관찰하기 쉽고, 이웃과 쉽게 구별 할 수 있으며, 개별적으로 타겟팅 될 수 있습니다. 수십 년 동안 레이저 절제는 배아 발달을 연구하는 데 사용되어 왔습니다. 여기서, 갈색 알가 S. 라티시마의 초기 배아를 위해 세포 특이적 레이저 절제를위한 프로토콜이 개발되었다. 제시된 연구에는 (1) 배양 조건을 포함한 중요한 매개 변수에 대한 설명과 함께 사카리나 배아의 준비, (2) 레이저 절제 설정, (3) 타임랩스 현미경을 사용하여 조사 된 배아의 후속 성장 모니터링이 포함됩니다. 또한, 이미징 플랫폼에서 실험실로 배아를 다시 운반하기위한 최적의 조건에 대한 세부 사항이 제공되며, 이는 후속 배아 발달에 중대한 영향을 줄 수 있습니다. Laminariales 순서에 속하는 조류는 Saccharina와 유사한 배아 발생 패턴을 표시하며; Algae belonging to the order Laminariales display embryogenesis pattern similar to Saccharina; 따라서 이 프로토콜은 이 분류에서 다른 종으로 쉽게 옮겨질 수 있다.
Introduction
레이저 절제는 배아 발달을 연구하기 위해 수십 년 동안 사용되어 왔습니다. 레이저 빔으로 배아 세포를 조사하면 배아 발생 동안 세포 계보의 재생 잠재력 및 변형을 모니터링하고 세포 분열 및 세포 운명에 대한 표적 절제의 영향을 조사 할 수 있습니다. 레이저 절제 방법에 사용되는 모델 유기체는 전형적으로 동물, 예컨대 곤충 1,2, 선충류 3,4, 척추동물 5,6, 및 때때로 식물 7,8이다. 또한, 레이저 미세 절제 접근법이 초기 배아 9,10의 광분극에서 세포벽의 역할을 입증하기 위해 1994 년과1998 년에 갈색 알가 푸쿠스에 사용되었다.
갈색 조류는 1.6 억 년 전에 진핵 나무의 뿌리에서 갈라진 Stramenopiles 그룹에 속합니다. 결과적으로, 이들은 동물 및 식물(11)과 같은 다른 다세포 유기체와 계통유전학적으로 독립적이다. Saccharina latissima는 다시마로 더 일반적으로 알려진 Laminariales 순서에 속하며 지구상에서 가장 큰 유기체 중 하나이며 30m 이상의 크기에 도달합니다. Saccharina sp.는 식품 및 사료와 같은 많은 응용 분야에 사용되는 대형 해초이며 다당류는 전 세계 농업, 약리학 및 화장품 산업에 사용하기 위해 추출됩니다12, 13. 주로 아시아에서, 그리고 최근에는 유럽에서 재배를하기 위해서는 바다에서 청소년을 방출하기 전에 부화장에서 배아를 준비해야합니다. 모든 켈프와 마찬가지로, 그것은 반수체 gametophyte가 성장하고 수정을위한 게이머를 생산하는 현미경 게임 토피틱 단계로 구성된 이단계 생활주기와 큰 평면 블레이드가 해저 또는 암석에 부착 된 홀드 패스트에서 발달하는 이배체 거시적 인 산포 성 단계. 스포로피테는 성숙 시에 반수체 포자를 방출하여 수명주기14,15,16을 완료한다.
S. latissima는 몇 가지 흥미로운 형태학적 특징을 제시한다17. 그것의 배아는 다른 조직 유형의 출현과 일치하는 다층 구조를 획득하기 전에 단층 평면 시트15,18,19로 발전합니다. 또한, Laminariales는 배아가 모성 게임 피텍 조직에 붙어있는 갈색 조류의 유일한 택시 중 하나입니다 (Desmarestiales와 Sporochnales도15 세입니다). 이 기능은이 발달 과정에서 모성 조직의 역할을 연구하고 갈조류의 모성 조절 메커니즘을 동식물의 모성 조절 메커니즘과 비교할 수있는 기회를 제공합니다.
이 기사는 초기 다시마 배아에서 레이저 절제를위한 최초의 완전한 프로토콜을 제시합니다. UV ns-펄스 기술을 포함하는 이 프로토콜은 배아 발생 동안 각각의 역할을 연구하기 위해 개별 배아 세포의 특이적 파괴를 초래한다. 이 절차는 Laminariales에서 배아 발생 중 세포 상호 작용과 세포 운명을 조사하기위한 신뢰할 수있는 접근법을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
국소 세포 레이저 절제술은 높은 수준의 정밀도로 시간적, 공간적 절제를 허용합니다. 그러나, 그의 효율은 표적 세포의 접근성 불능에 의해 방해받을 수 있다; 예를 들어, 모든 세포는 입체 배아로 되어 있다. 이 프로토콜은 alga Saccharina latissima의 배아에서 개발되었으며, 모든 세포를 쉽게 구별하고 레이저 빔으로 개별적으로 파괴 할 수있는 단층 라미나를 개발합니다.
…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.B.의 박사 학위 교부금은 지역 브레타뉴 (ARED 보조금 번호 COH20020)와 소르본 대학 (Sorbonne Université)이 지원합니다. I.T.is PhD 보조금은 지역 브레타뉴 (ARED 보조금 번호 COH18020)와 Norvegian NMBU University가 자금을 지원합니다. 이 프로젝트는 MITI 학제 간 프로그램을 통해 CNRS로부터 재정 지원을 받았습니다. MRic은 프랑스 국립 연구소 (ANR-10-INBS-04)가 지원하는 국가 인프라 France-BioImaging 회원입니다.
Materials
| 25 mm glass bottom petri dish | NEST | 801001 | |
| Autoclaved sea water | – | Collected offshore near the Astan buoy (48°44.934 N 003°57.702 W) close to Roscoff, France, at a depth of 20 m. | |
| Cell scraper | MED 2 | 83.3951 | |
| Cell strainer 40 µm | Corning / Falcon | 352340 | |
| Culture cabinets | Snijders Scientific Plant Growth Cabinet ECD01 | Any other brand is suitable provided that the light intensity, the photoperiod and the temperature can be controlled. | |
| LSM 880 Zeiss confocal microscope | Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany | Ablation and imaging were performed using a 40x/1.2 water objective | |
| Pellet pestles | Sigma Aldrich | Z359947 | Blue polypropylene (autoclavable) |
| Provasoli supplement | – | Recipe is available here: http://www.sb-roscoff.fr/sites/www.sb-roscoff.fr/files/documents/station-biologique-roscoff-preparation-du-provasoli-2040.pdf | |
| Pulsed 355 laser (UGA-42 Caliburn 355/25) | Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany | ||
| Scalpel | Paramount | PDSS 11 | |
| SysCon software | Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany | Laser-driver software | |
| ZEN software | Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany | Imaging software, used together with the SysCon software; Black 2.3 version |
References
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