Ablación dirigida con láser en el embrión de Saccharina latissima
Summary
La destrucción de células específicas en el embrión es una herramienta poderosa para estudiar las interacciones celulares involucradas en el destino celular. El presente protocolo describe técnicas para la ablación con láser de células diana en el embrión temprano del alga marrón Saccharina latissima.
Abstract
En Saccharina latissima, el embrión se desarrolla como una lámina celular monocapa llamada lámina o cuchilla. Cada célula embrionaria es fácil de observar, fácilmente distinguible de sus vecinas, y puede ser dirigida individualmente. Durante décadas, la ablación con láser se ha utilizado para estudiar el desarrollo embrionario. Aquí, se desarrolló un protocolo para la ablación con láser específica de la célula para embriones tempranos del alga marrón S. latissima. El trabajo presentado incluye: (1) la preparación de embriones de Saccharina , con una descripción de los parámetros críticos, incluidas las condiciones de cultivo, (2) los ajustes de ablación con láser y (3) el monitoreo del crecimiento posterior del embrión irradiado mediante microscopía de lapso de tiempo. Además, se proporcionan detalles sobre las condiciones óptimas para transportar los embriones desde la plataforma de imágenes hasta el laboratorio, lo que puede afectar profundamente el desarrollo embrionario posterior. Las algas pertenecientes al orden Laminariales muestran patrones de embriogénesis similares a Saccharina; por lo tanto, este protocolo puede transferirse fácilmente a otras especies en este taxón.
Introduction
La ablación con láser se ha utilizado durante décadas para estudiar el desarrollo embrionario. La irradiación de células embrionarias con un rayo láser permite monitorear el potencial regenerativo y la modificación del linaje celular durante la embriogénesis e investigar el impacto de la ablación dirigida en la división celular y el destino celular. Los organismos modelo utilizados en los métodos de ablación con láser son típicamente animales, como insectos 1,2, nematodos 3,4, vertebrados 5,6 y ocasionalmente plantas 7,8. Además, se utilizó un enfoque de microablación láser en el alga marrón Fucus en 1994 y 1998 para demostrar el papel de la pared celular en la fotopolarización del embrión temprano 9,10.
Las algas pardas pertenecen al grupo Stramenopiles, divergieron en la raíz del árbol eucariota hace 1.600 millones de años. Como resultado, son filogenéticamente independientes de otros organismos multicelulares, como animales y plantas11. Saccharina latissima pertenece al orden Laminariales, más comúnmente conocido como algas marinas, y se encuentran entre los organismos más grandes de la tierra, alcanzando tamaños de más de 30 m. Saccharina sp. es un gran alga marina utilizada para muchas aplicaciones como alimentos y piensos, y sus polisacáridos se extraen para su uso en las industrias agrícola, farmacológica y cosmética en todo el mundo12, 13. Su cultivo, principalmente en Asia y más recientemente en Europa, requiere la preparación de embriones en criaderos antes de liberar juveniles en mar abierto. Como todas las algas marinas, tiene un ciclo de vida bifásico compuesto por una fase gametofítica microscópica, durante la cual un gametofito haploide crece y produce gametos para la fertilización, y una fase esporófita macroscópica diploide, donde se desarrolla una gran cuchilla plana desde su sujeción unida al fondo marino o las rocas. El esporófito libera esporas haploides en la madurez, completando así el ciclo de vida 14,15,16.
S. latissima presenta algunos rasgos morfológicos interesantes17. Su embrión se desarrolla como una lámina plana monocapa 15,18,19 antes de adquirir una estructura multicapa coincidiendo con la aparición de diferentes tipos de tejidos. Además, Laminariales es uno de los únicos taxones de algas pardas cuyos embriones permanecen adheridos a su tejido gametofítico materno (Desmarestiales y Sporochnales también lo hacen15). Esta característica ofrece la oportunidad de estudiar el papel del tejido materno en este proceso de desarrollo y comparar los mecanismos de control materno en algas marrones con los de animales y plantas.
Este artículo presenta el primer protocolo completo para la ablación con láser en un embrión temprano de algas marinas. Este protocolo que involucra la técnica UV ns-pulsada da como resultado la destrucción específica de células embrionarias individuales para estudiar sus respectivos roles durante la embriogénesis. El procedimiento ofrece un enfoque confiable para investigar las interacciones celulares y el destino celular durante la embriogénesis en Laminariales.
Protocol
Representative Results
Discussion
La ablación celular local con láser permite la ablación temporal y espacial con un alto nivel de precisión. Sin embargo, su eficiencia puede verse obstaculizada por la falta de accesibilidad de las células objetivo; por ejemplo, todas las células son de un embrión tridimensional. Este protocolo se desarrolló en el embrión del alga Saccharina latissima, que desarrolla una lámina monocapa en la que todas las células se pueden distinguir y destruir fácilmente individualmente con un rayo láser.
<p c…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La beca de doctorado de S.B. está financiada por la Región de Bretaña (número de subvención ARED COH20020) y la Universidad de la Sorbona. I.T.is beca de doctorado está financiada por la Región de Bretaña (número de subvención ARED COH18020) y la Universidad Norvegian NMBU. Este proyecto ha recibido apoyo financiero del CNRS a través de los programas interdisciplinarios del MITI. MRic es miembro de la infraestructura nacional France-BioImaging apoyada por la Agencia Nacional de Investigación de Francia (ANR-10-INBS-04).
Materials
| 25 mm glass bottom petri dish | NEST | 801001 | |
| Autoclaved sea water | – | Collected offshore near the Astan buoy (48°44.934 N 003°57.702 W) close to Roscoff, France, at a depth of 20 m. | |
| Cell scraper | MED 2 | 83.3951 | |
| Cell strainer 40 µm | Corning / Falcon | 352340 | |
| Culture cabinets | Snijders Scientific Plant Growth Cabinet ECD01 | Any other brand is suitable provided that the light intensity, the photoperiod and the temperature can be controlled. | |
| LSM 880 Zeiss confocal microscope | Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany | Ablation and imaging were performed using a 40x/1.2 water objective | |
| Pellet pestles | Sigma Aldrich | Z359947 | Blue polypropylene (autoclavable) |
| Provasoli supplement | – | Recipe is available here: http://www.sb-roscoff.fr/sites/www.sb-roscoff.fr/files/documents/station-biologique-roscoff-preparation-du-provasoli-2040.pdf | |
| Pulsed 355 laser (UGA-42 Caliburn 355/25) | Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany | ||
| Scalpel | Paramount | PDSS 11 | |
| SysCon software | Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany | Laser-driver software | |
| ZEN software | Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany | Imaging software, used together with the SysCon software; Black 2.3 version |
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