אבלציה ממוקדת לייזר בעובר של סכרינה לטיסימה
Summary
השמדת תאים ספציפיים בעובר היא כלי רב עוצמה לחקר אינטראקציות תאיות המעורבות בגורל התא. הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכניקות לאבלציה בלייזר של תאים ממוקדים בעובר המוקדם של האצה החומה Saccharina latissima.
Abstract
ב Saccharina latissima, העובר מתפתח כמו יריעת תא חד שכבתית הנקראת למינה או הלהב. כל תא עובר קל לצפייה, ניתן להבחין בקלות בין שכניו לבין שכניו, וניתן לפגוע בו בנפרד. במשך עשרות שנים, אבלציה בלייזר שימשה לחקר התפתחות העוברים. כאן פותח פרוטוקול לאבלציה בלייזר ספציפי לתא עבור עוברים מוקדמים של האצה החומה S. latissima. העבודה המוצגת כוללת: (1) הכנת עוברי סכרינה , עם תיאור הפרמטרים הקריטיים, כולל תנאי תרבית, (2) הגדרות אבלציה בלייזר, ו-(3) ניטור הצמיחה שלאחר מכן של העובר המוקרן באמצעות מיקרוסקופיה של קיטועי זמן. בנוסף, מסופקים פרטים על התנאים האופטימליים להעברת העוברים מפלטפורמת ההדמיה בחזרה למעבדה, מה שיכול להשפיע עמוקות על התפתחות העוברים הבאים. אצות השייכות לסדר למינריאלס מציגות תבניות עובריות הדומות לסכרינה; כך ניתן להעביר פרוטוקול זה בקלות למינים אחרים בטקסון זה.
Introduction
אבלציה בלייזר משמשת כבר עשרות שנים לחקר התפתחות העוברים. הקרנת תאי עובר באמצעות קרן לייזר מאפשרת לעקוב אחר הפוטנציאל הרגנרטיבי והשינוי של שושלת התאים במהלך העובר ולחקור את ההשפעה של אבלציה ממוקדת על חלוקת התא ועל גורל התא. אורגניזמי המודל המשמשים בשיטות אבלציה בלייזר הם בדרך כלל בעלי חיים, כגון חרקים 1,2, נמטודות 3,4, בעלי חוליות 5,6, ולעיתים צמחים 7,8. בנוסף, נעשה שימוש בגישת מיקרו-אבלציה בלייזר על האצה החומה פוקוס בשנים 1994 ו-1998 כדי להדגים את תפקידו של דופן התא בפוטו-פולריזציה של העובר המוקדם 9,10.
אצות חומות שייכות לקבוצה Stramenopiles, שהתפצלה בשורש העץ האאוקריוטי לפני 1.6 מיליארד שנה. כתוצאה מכך, הם אינם תלויים מבחינה פילוגנטית באורגניזמים רב-תאיים אחרים, כגון בעלי חיים וצמחים11. Saccharina latissima שייך לסדר Laminariales, הידוע יותר בשם kelps, והם בין האורגניזמים הגדולים ביותר על פני כדור הארץ, המגיעים לגדלים של מעל 30 מ ‘. Saccharina sp. היא אצה גדולה המשמשת ליישומים רבים כגון מזון והזנה, והפוליסכרידים שלה מופקים לשימוש בתעשיות החקלאיות, הפרמקולוגיות והקוסמטיות ברחבי העולם12, 13. גידולו, בעיקר באסיה ולאחרונה באירופה, דורש הכנת עוברים במדגרות לפני שחרור צעירים בים הפתוח. כמו כל הקלפים, יש לו מחזור חיים דו-פאזי המורכב משלב גמטופיטי מיקרוסקופי, שבמהלכו גמטופיט הפלואידי גדל ומייצר גמטות להפריה, ופאזה מקרוסקופית דיפלואידית, שבה מתפתח להב מישורי גדול מתוך ההחזקה שלו המחובר לקרקעית הים או לסלעים. הספורופיט משחרר נבגים הפלואידים בבגרותם, ובכך משלים את מחזור החיים 14,15,16.
S. latissima מציג כמה תכונות מורפולוגיות מעניינות17. העובר שלו מתפתח כסדין מישורי חד-שכבתי 15,18,19 לפני שהוא רוכש מבנה רב שכבתי במקביל להופעתם של סוגי רקמות שונים. בנוסף, Laminariales היא אחת הטקסות היחידות של אצות חומות שהעוברים שלהן נשארים מחוברים לרקמה הגמטופיטית האימהית שלהן (Desmarestiales ו-Sporochnales עושים גםהם 15). תכונה זו מציעה את ההזדמנות לחקור את תפקידה של הרקמה האימהית בתהליך התפתחותי זה ולהשוות את מנגנוני הבקרה האימהיים באצות חומות עם אלה בבעלי חיים ובצמחים.
מאמר זה מציג את הפרוטוקול המלא הראשון לאבלציה בלייזר בעובר אצות מוקדם. פרוטוקול זה, הכולל טכניקה של UV ns-pulsed, גורם להרס ספציפי של תאי עובר בודדים כדי לחקור את תפקידם במהלך יצירת עוברים. ההליך מציע גישה אמינה לחקר אינטראקציות בין תאים וגורל התאים במהלך עוברי בלמינריאלס.
Protocol
Representative Results
Discussion
אבלציה מקומית בלייזר תאי מאפשרת אבלציה טמפורלית ומרחבית ברמת דיוק גבוהה. עם זאת, יעילותו עלולה להיפגע על ידי אי הנגישות של תאי המטרה; לדוגמה, כל התאים הם של עובר תלת מימדי. פרוטוקול זה פותח על העובר של אצה Saccharina latissima, אשר מפתחת למינה חד שכבתית שבה ניתן להבחין בקלות בין כל התאים ולהשמיד ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מענק הדוקטורט של S.B. ממומן על ידי אזור ברטאן (מענק ARED מספר COH20020) ואוניברסיטת סורבון. מענק הדוקטורט I.T.is ממומן על ידי אזור ברטאן (מענק ARED מספר COH18020) ואוניברסיטת NMBU הנורווגית. פרויקט זה קיבל תמיכה כספית מה- CNRS באמצעות התוכניות הבין-תחומיות של MITI. MRic הוא חבר בתשתית הלאומית צרפת-הדמיה ביולוגית הנתמכת על ידי סוכנות המחקר הלאומית הצרפתית (ANR-10-INBS-04).
Materials
| 25 mm glass bottom petri dish | NEST | 801001 | |
| Autoclaved sea water | – | Collected offshore near the Astan buoy (48°44.934 N 003°57.702 W) close to Roscoff, France, at a depth of 20 m. | |
| Cell scraper | MED 2 | 83.3951 | |
| Cell strainer 40 µm | Corning / Falcon | 352340 | |
| Culture cabinets | Snijders Scientific Plant Growth Cabinet ECD01 | Any other brand is suitable provided that the light intensity, the photoperiod and the temperature can be controlled. | |
| LSM 880 Zeiss confocal microscope | Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany | Ablation and imaging were performed using a 40x/1.2 water objective | |
| Pellet pestles | Sigma Aldrich | Z359947 | Blue polypropylene (autoclavable) |
| Provasoli supplement | – | Recipe is available here: http://www.sb-roscoff.fr/sites/www.sb-roscoff.fr/files/documents/station-biologique-roscoff-preparation-du-provasoli-2040.pdf | |
| Pulsed 355 laser (UGA-42 Caliburn 355/25) | Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany | ||
| Scalpel | Paramount | PDSS 11 | |
| SysCon software | Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany | Laser-driver software | |
| ZEN software | Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany | Imaging software, used together with the SysCon software; Black 2.3 version |
References
- Montell, D. J., Keshishian, H., Spradling, A. C. Laser ablation studies of the role of the Drosophila oocyte nucleus in pattern formation. Science. 254 (5029), 290-293 (1991).
- Shivakumar, P. C., Lenne, P. F. Laser ablation to probe the epithelial mechanics in drosophila. Methods In Molecular Biology. 1478, 241-251 (2016).
- Bargmann, C. I., Avery, L. Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Modern Biological Analysis of an Organism. 48, 225-250 (1995).
- Fouad, A. D., Liu, A., Du, A., Bhirgoo, P. D., Fang-Yen, C. Thermal laser ablation with tunable lesion size reveals multiple origins of seizure-like convulsions in Caenorhabditis elegans. Scientific Reports. 11 (1), 5084 (2021).
- Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. Journal of Visualized Experiments. (54), e2845 (2011).
- Mondia, J. P., Adams, D. S., Orendorff, R. D., Levin, M., Omenetto, F. G. Patterned femtosecond-laser ablation of Xenopus laevis melanocytes for studies of cell migration, wound repair, and developmental processes. Biomedical Optics Express. 2 (8), 2383-2391 (2011).
- Reinhardt, D., Frenz, M., Mandel, T., Kuhlemeier, C. Microsurgical and laser ablation analysis of leaf positioning and dorsoventral patterning in tomato. Development. 132 (1), 15-26 (2005).
- Berg, C., Hage, W., Weisbeek, P., Scheres, B. Laser ablation in Arabidopsis roots: a tool to study cell-to-cell communication. Cellular integration of signalling pathways in plant development. Proceedings of the NATO Advanced Study Institute. , 237-250 (1998).
- Berger, F., Taylor, A., Brownlee, C. Cell fate determination by the cell wall in early fucus development. Science. 263 (5152), 1421-1423 (1994).
- Bouget, F. Y., Berger, F., Brownlee, C. Position dependent control of cell fate in the Fucus embryo: role of intercellular communication. Development. 125 (11), 1999-2008 (1998).
- Bringloe, T., et al. Phylogeny and evolution of the brown algae. Critical Reviews in Plant Sciences. 39 (4), 281-321 (2020).
- Saifullah, S., Olsen, Y., Surilayani, D., Handå, A. Carbohydrate of the brown seaweed, saccharina latissima: a review. Joint proceedings of the 2nd and the 3rd International Conference on Food Security Innovation (ICFSI 2018-2019). , 180-182 (2021).
- Zhang, X., Thomsen, M. Techno-economic and environmental assessment of novel biorefinery designs for sequential extraction of high-value biomolecules from brown macroalgae Laminaria digitata, Fucus vesiculosus, and Saccharina latissima. Algal Research. 60, 102499 (2021).
- Kanda, T. On the gametophytes of some japanese species of laminariales. Scientific papers of the Institute of Algological Research, Faculty of Science. 1 (2), 221-260 (1936).
- Fritsch, F. E. . The structure and reproduction of the algae. Volume 2. , (1945).
- Bartsch, I., et al. The genus Laminaria sensu lato : recent insights and developments. European Journal of Phycology. 43 (1), 1-86 (2008).
- Theodorou, I., Charrier, B., Boutet, A., Schierwater, B. Chapter 2: Brown algae: ectocarpus and saccharina as experimental models for developmental biology. Handbook of Marine Model Organisms in Experimental Biology – Established and Emerging. , 485 (2021).
- Drew, G. H. The reproduction and early development of laminaria digitata and laminaria saccharina. Annals of Botany. 24 (1), 177-189 (1910).
- Yendo, K. The development of costaria, undaria, and laminaria. Annals of Botany. 25 (99), 691-715 (1911).
- Forbord, S., Steinhovden, K., Rød, K., Handå, A., Skjermo, J., Charrier, B., Wichard, T., Reddy, C. R. K. Cultivation protocol for Saccharina latissima. Protocols for Macroalgae Research. , 37-59 (2018).
- Bartsch, I., Charrier, B., Wichard, T., Reddy, C. R. K. Derivation of clonal stock cultures and hybridization of kelps. Protocols for Macroalgae Research. , 61-78 (2018).
- Theodorou, I., Opsahl-Sorteberg, H. -. G., Charrier, B. Preparation of zygotes and embryos of the kelp saccharina latissima for cell biology approaches. Bio-protocol. 101, 4132 (2021).
- Lüning, K., Dring, M. J. Reproduction induced by blue light in female gametophytes of Laminaria saccharina. Planta. 104 (3), 252-256 (1972).
- de Medeiros, G., et al. Cell and tissue manipulation with ultrashort infrared laser pulses in light-sheet microscopy. Scientific Reports. 10 (1), 1942 (2020).
- Liang, X., Michael, M., Gomez, G. A. Measurement of mechanical tension at cell-cell junctions using two-photon laser ablation. Bio-protocol. 6 (24), 2068 (2016).
- Ebbing, A., Pierik, R., Bouma, T., Kromkamp, J. C., Timmermans, K. How light and biomass density influence the reproduction of delayed Saccharina latissima gametophytes (Phaeophyceae). Journal of Phycology. 56 (3), 709-718 (2020).
- Rabillé, H., Billoud, B., Tesson, B., Le Panse, S., Rolland, &. #. 2. 0. 1. ;., Charrier, B. The brown algal mode of tip growth: Keeping stress under control. PLoS Biology. 17 (1), 2005258 (2019).
